臨床級別人誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞的建立與鑒定.pdf

1、在希臘神話中，泰坦巨人普羅米修斯因為受到宙斯的懲罰，肝臟不斷地被神鷹啄食。神奇的是他被啄食的肝臟可以不斷地再生，使得生命得以維持。現(xiàn)代社會，由于慢性病引起的組織器官衰竭或者意外事故引起的組織器官損傷病人越來越多。面對這類疾病，傳統(tǒng)的醫(yī)療手段往往顯得無能為力，人類急需把神話變?yōu)楝F(xiàn)實。再生醫(yī)學(xué)是研究用正常的細(xì)胞、組織或者器官替換受損的細(xì)胞、組織或器官行使功能或者用一定的手段誘導(dǎo)受損的細(xì)胞、組織或器官再生的學(xué)科，是未來醫(yī)學(xué)的一個重要研究方向。

2、細(xì)胞、組織或者器官的供體不足是限制再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要因素之一。
　　人多潛能干細(xì)胞(human Pluripotent Stem Cells，hPSCs)包括人胚胎干細(xì)胞(humanEmbryonic Stem cells，hESCs)和人誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(human induced Pluripotent StemCells，hiPSCs)，具有無限的增殖能力和分化形成機(jī)體內(nèi)所有細(xì)胞類型的潛能，理論上來說可以源源不斷的為再生醫(yī)

3、學(xué)提供各種類型的細(xì)胞、組織和器官，應(yīng)用前景巨大。自從Thomson實驗室建立了第一株hESCs以來，科學(xué)家就一直在HPSCs的臨床應(yīng)用這條道路上不斷地探索，并取得了一系列的成果。但是hESCs是從發(fā)育早期的人類胚胎中建系獲取的，涉及到了倫理道德問題，其科學(xué)研究和臨床應(yīng)用一直備受爭議。hiPSCs是通過一定的手段（導(dǎo)入外源基因或者使用化學(xué)小分子）將體細(xì)胞重編程獲得的，和hESCs具有相同的特性和臨床應(yīng)用價值，并且能規(guī)避hESCs所涉及到的

4、倫理問題。
　　重編程效率低下，外源基因隨機(jī)整合和自發(fā)激活，動物源性物質(zhì)的使用，基因組和表觀遺傳學(xué)的穩(wěn)定性等是影響hiPSCs臨床應(yīng)用的重要問題。隨著科學(xué)研究的深入，這些問題也正在被逐步解決，hiPSCs的臨床應(yīng)用時機(jī)已經(jīng)趨于成熟。日本科學(xué)家正在用hiPSCs分化形成的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（Retinal Pigmented Epithelial cells，RPE）進(jìn)行治療年齡相關(guān)性黃斑變性的臨床試驗。到目前為止，接受細(xì)胞移植的患

5、者沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，視力有所改善。
　　為了保證臨床應(yīng)用的合法性、安全性、有效性和可追溯性，臨床應(yīng)用的hiPSCs應(yīng)該滿足以下幾點要求:
　　(1)供體細(xì)胞捐獻(xiàn)過程符合《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》和《組織捐獻(xiàn)條例》中的相關(guān)規(guī)定及倫理道德規(guī)范;
　　(2)供體細(xì)胞取材方便;
　　(3)在臨床應(yīng)用過程中，難免會涉及到一些年紀(jì)較大個體細(xì)胞的重編程，細(xì)胞供體的年齡越大，細(xì)胞越不容易被重編程，為了保證成功

6、率，應(yīng)該選擇高效的重編程方法;
　　(4)為了避免外源基因隨機(jī)整合到基因組中引起的插入突變和外源基因自發(fā)激活導(dǎo)致的致瘤性，以臨床應(yīng)用為目的的hiPSCs應(yīng)該不含有外源重編程因子;
　　(5)國際上的干細(xì)胞協(xié)會和大多數(shù)國家都要求或者鼓勵臨床應(yīng)用細(xì)胞的操作規(guī)程符合優(yōu)良制造標(biāo)準(zhǔn)（Good Manufacturing Practice，GMP），所以從供體細(xì)胞的采集，hiPSCs的誘導(dǎo)到hiPSCs的定向分化等操作流程和制造環(huán)境都應(yīng)

7、該符合GMP標(biāo)準(zhǔn);
　　(6)為了避免動物源性病原體在人畜之間交叉?zhèn)鞑?，在以臨床應(yīng)用為目的的細(xì)胞培養(yǎng)過程中最好要避免動物源性成分的添加;
　　(7)對于以臨床應(yīng)用為目的的細(xì)胞，我們要做細(xì)菌、真菌、支原體、一些特殊種類病原體的檢測，確保其具有生物安全性。
　　雖然目前世界上有一些臨床級別hiPSCs的報道，但是在這些研究中，科學(xué)家基本上都是將研究級別的hiPSCs通過在無動物源性的培養(yǎng)液中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成所謂的臨床級別的hiP

8、SCs，或者是將研究級別的供體細(xì)胞通過在無動物源性的培養(yǎng)液中重編程，獲得所謂的臨床級別的hiPSCs。所獲得的hiPSCs都與含有動物源性的培養(yǎng)液接觸過，給其臨床應(yīng)用增加了潛在動物源性病原體感染的風(fēng)險。在僅有的一項完全從無動物源性培養(yǎng)液中建系的hiPSCs的報道中，研究者沒有對其生物安全性進(jìn)行檢測，也沒有描述供體細(xì)胞的捐獻(xiàn)過程是否符合《組織捐獻(xiàn)條例》。所以以符合《組織捐獻(xiàn)條例》細(xì)胞為供體細(xì)胞，在無動物源性的培養(yǎng)液中和符合GMP操作規(guī)范和

9、環(huán)境下從頭建立臨床級別的hiPSCs并對其進(jìn)行全面的生物安全性檢測對于hiPSCs更加安全有效和規(guī)范的應(yīng)用于臨床是十分必要的。
　　基于臨床用hiPSCs的基本要求和目前臨床級別hiPSCs的研究現(xiàn)狀，我們進(jìn)行了以下研究:
　　(1)初步用慢病毒體系優(yōu)化取材方便的人臍帶血單個核細(xì)胞(human Umbilical CordBlood Mononuclear Cells, hUCBMCs)重編程為hiPSCs的流程，提高其重編

10、程效率和成功率;
　　(2)在不使用原癌基因C-Myc的情況下，優(yōu)化用攜帶Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四因子的非整合型質(zhì)粒誘導(dǎo)hiPSCs的方法，高效穩(wěn)定獲得不攜帶外源基因的hiPSCs;
　　(3)在前期優(yōu)化重編程方法的研究中，我們發(fā)現(xiàn)不同個體來源的人體細(xì)胞的重編程效率不同，這種效率的差異和供體的年齡無關(guān)。對這些細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq測序，并對其基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，找出了不同個體來源的人體細(xì)胞重編程效率不同的機(jī)

11、制;
　　(4)基于以上探索，最后，以符合《組織捐獻(xiàn)條例》的人包皮成纖維細(xì)胞為供體細(xì)胞，在符合GMP環(huán)境規(guī)范和操作規(guī)范的條件下和Xeno-free培養(yǎng)液中從頭建立非整合型臨床級別hiPSCs，并對其細(xì)胞特性，分化能力和生物安全性做全面檢測。
　　上述研究結(jié)果表明:
　　(1)在重編程之前，將懸浮生長的hUCBMCs接種到包被MesenCult-XF基質(zhì)的培養(yǎng)皿中，使其轉(zhuǎn)化成貼壁生長狀態(tài);在重編程的過程中，用向貼壁不牢固

12、的供體細(xì)胞中加飼養(yǎng)層細(xì)胞的方式取代將供體細(xì)胞消化下來接種到飼養(yǎng)層細(xì)胞上的方式，提高供體細(xì)胞貼壁和存活效率;能大幅度提高h(yuǎn)UCBMCs的重編程效率和成功率;
　　(2)在采用效率比較高的電轉(zhuǎn)染方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到供體細(xì)胞中的情況下，在重編程過程中使用重編程效率比較高的X培養(yǎng)液的前提下，攜帶Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四因子的非整合型質(zhì)粒(PCEP4-OSKN)能夠高效重編程HFF-21WF細(xì)胞，誘導(dǎo)效率顯著高于已經(jīng)報道的不含

13、有C-Myc等原癌基因的非整合型質(zhì)粒的重編程效率，并且可以在不使用任何和表觀遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)小分子的情況下誘導(dǎo)獲得hiPSCs;
　　(3)攜帶Oct4、Sox2、Klf4、Nanog四因子的非整合型質(zhì)粒(PCEP4-OSKN)不能成功重編程臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，hUCMSCs)和其它個體來源的HFF細(xì)胞;
　　(4)對四個不同個體來源的HFF

14、細(xì)胞（HFF-21WF，HFF-19WM，HFF-16 WM和HFF-6Y）和一個個體來源的hUCMSCs(UCMSC-21WF)進(jìn)行RNA-Seq測序，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，能被PCEP4-OSKN重編程的HFF細(xì)胞和不能夠被PCEP4-OSKN重編程的細(xì)胞基因表達(dá)差異主要集中在細(xì)胞連接分子和TGFβ信號通路上;
　　(5)以符合《組織捐獻(xiàn)條例》的在Xeno-free培養(yǎng)液中和符合GMP操作規(guī)范和環(huán)境規(guī)范的條件下原代和傳代培養(yǎng)的人包