阿爾巴斯白絨山羊誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞生成的研究.pdf

1、阿爾巴斯白絨山羊是內(nèi)蒙古自治區(qū)優(yōu)良家畜品種，屬絨肉兼優(yōu)型珍稀品種，其絨毛被視為“軟黃金”，肉被視為“肉中人參”，在我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有十分重要的地位。利用現(xiàn)代生物技術(shù)建立阿爾巴斯白絨山羊多能干細(xì)胞系不僅可以為相關(guān)學(xué)科的發(fā)展提供理論依據(jù)，同時(shí)在其遺傳育種方面也具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。雖然目前對(duì)家畜干細(xì)胞的研究不斷深入，但其胚胎干細(xì)胞的建系一直未能成功。近年來隨著誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞技術(shù)的興起，利用特定因子誘導(dǎo)成體細(xì)胞重編程成多潛能干細(xì)胞已成

2、為可能。
　　本研究將特定轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，獲得阿爾巴斯白絨山羊誘導(dǎo)性多潛能性干細(xì)胞（giPSCs）。對(duì)giPSCs表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記蛋白、細(xì)胞核型、體外三胚層分化的類胚體以及體內(nèi)畸胎瘤形成能力進(jìn)行觀察，并對(duì)giPSCs進(jìn)行全基因表達(dá)譜芯片分析，進(jìn)一步了解其重編程情況，探索研究其分子機(jī)制，為絨山羊胚胎干細(xì)胞的建系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1 giPSCs的建系
　　1.1 giPSCs的生成

3、　　利用強(qiáng)力霉素(Dox)誘導(dǎo)性慢病毒載體，將特定干細(xì)胞多能性轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)轉(zhuǎn)入阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞(GFFs)使細(xì)胞重編程，約20d后可見小鼠胚胎干細(xì)胞樣克隆生成，即giPSCs。giPSCs呈立體狀生長(zhǎng)，橢圓形、表面光滑、折光性強(qiáng)。第28d，經(jīng)堿性磷酸酶(AP)染色鑒定，約80％的克隆呈陽(yáng)性。
　　1.2 giPSCs的多能性檢測(cè)
　　免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示giPSCs表達(dá)O

4、CT4、SOX2、NANOG、SSEA-1、TRA-1-60和TRA-1-81等胚胎干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白，而不表達(dá)SSEA-3和SSEA-4。RT-PCR結(jié)果顯示giPSCs表達(dá)OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、REX1等胚胎干細(xì)胞標(biāo)記基因。giPSCs能在體外自分化形成具有三胚層分化的類胚體，經(jīng)免疫熒光檢測(cè)具有外胚層標(biāo)記蛋白Ⅲβ-Tubulin、中胚層標(biāo)記蛋白Desmin和內(nèi)胚層標(biāo)記蛋白Cytokeratin的表達(dá);g

5、iPSCs能在體內(nèi)分化形成畸胎瘤，經(jīng)組織切片染色檢測(cè)具有腺體樣組織（內(nèi)胚層）、肌肉組織（中胚層）和神經(jīng)組織（外胚層）的分化。giPSCs具有正常核型，為58+XX。
　　2 giPSCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件的優(yōu)化
　　2.1轉(zhuǎn)錄因子的搭配和培養(yǎng)基的優(yōu)化
　　轉(zhuǎn)錄因子組合OSMK（將Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc組合至一個(gè)載體中）、Oct4+Sox2+Klf4+c-Myc和Oct4+Sox2+Klf4都能誘導(dǎo)GFFs

6、生成giPSCs。其中OSMK病毒感染的細(xì)胞，每5×104個(gè)細(xì)胞中可獲得22.8±2.9個(gè)AP陽(yáng)性克隆，克隆重編程成度高，不易分化，內(nèi)源基因OCT4和NANOG高表達(dá)(P＜0.01);Oct4+Sox2+Klf+c-Myc病毒組感染的細(xì)胞，每5×104個(gè)細(xì)胞中可得23.8±2.2個(gè)AP陽(yáng)性克隆，長(zhǎng)期傳代后高代克隆易分化，克隆中內(nèi)源的Sox2基因高表達(dá)（P＜0.01）;Oct4+Sox2+Klf4病毒組感染的細(xì)胞，每5×104個(gè)細(xì)胞中只獲

7、得5.0±1.0個(gè)AP陽(yáng)性克隆，克隆中內(nèi)源基因OCT4、SOX2和NANOG的表達(dá)水平低(P＜0.01)，克隆易分化。培養(yǎng)基中逐步添加小分子化合物Vc、VPA和LiCl，統(tǒng)計(jì)每5×104個(gè)細(xì)胞中生成的giPSCs的AP陽(yáng)性克隆數(shù)發(fā)現(xiàn)，含有Vc的培養(yǎng)基中可形成平均17.5±1.3個(gè)陽(yáng)性克隆，與未添加小分子的培養(yǎng)基相比干細(xì)胞標(biāo)記基因OCT4、SOX2和NANOG的表達(dá)水平顯著提高(P＜0.01);含有VPA+LiCl的培養(yǎng)基中可形成平均24

8、.8±2.1個(gè)陽(yáng)性克隆，OCT4和NANOG基因的表達(dá)水平顯著提高(P＜0.01);含有Vc+VPA+LiCl的培養(yǎng)基中可形成平均28.9±0.75個(gè)陽(yáng)性克隆，與前兩組相比干細(xì)胞標(biāo)記基因OCT4、SOX2、NANOG的表達(dá)水平再次提高。結(jié)果表明培養(yǎng)基中添加小分子化合物Vc、VPA和LiCl能有效提高重編程效率。
　　2.2飼養(yǎng)層和靶細(xì)胞的選擇
　　實(shí)驗(yàn)中分別選擇了昆明白小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞(GF

9、F)、山羊胎兒成纖維細(xì)胞和小鼠胎兒成纖維細(xì)胞1∶1混合(MEF+GFF)細(xì)胞作為giPSCs的飼養(yǎng)層細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，giPSCs在MEF飼養(yǎng)層上的生長(zhǎng)增殖速度比較慢，細(xì)胞暗淡，折光性差，易分化，內(nèi)源基因OCT4、SOX2、NANOG的表達(dá)水平較低(P＜0.05)。相比于MEF飼養(yǎng)層，GFF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的giPSCs克隆質(zhì)量?jī)?yōu)，克隆光滑圓潤(rùn)，邊緣清晰，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快。內(nèi)源基因OCT4、SOX2、NANOG的表達(dá)水平高(P＜0.05)。M

10、EF+GFF飼養(yǎng)層上的細(xì)胞克隆與小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的細(xì)胞克隆相似。結(jié)果表明同源的GFF飼養(yǎng)層更適合giPSCs的增殖生長(zhǎng)。靶細(xì)胞的選擇上，本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞(GFFs)、肺間充質(zhì)干細(xì)胞(LMSCs)、骨髓間充干細(xì)胞(BMSCs)、初級(jí)毛乳頭細(xì)胞(PHFDPCs)、次級(jí)毛乳頭細(xì)胞(SHFDPCs)以及成體成纖維細(xì)胞(GEFs)均能獲得giPSCs。其中GFFs的重編程效率最高，每5×104個(gè)細(xì)胞中可形成2

11、4.7±2.1個(gè)AP陽(yáng)性克隆;其次是PHFDPCs，每5×104個(gè)細(xì)胞中可形成20.8±1.7個(gè)AP陽(yáng)性克隆，而相同條件下SHFDPCs中僅生成15.3±1.5個(gè);兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的重編程效率低于GFFs和PHFDPCs，LMSCs每5×104個(gè)細(xì)胞中可形成17.4±1.2個(gè)AP陽(yáng)性克隆，BMSCs的為18.7±2.2個(gè);成體成纖維細(xì)胞的重編程效率較低，每5×104個(gè)細(xì)胞中只形成10.4±1.8個(gè)AP陽(yáng)性克隆。證明PHFDPCs和GFF

12、s比較適合giPSCs的重編程。
　　3 giPSCs的全基因表達(dá)譜分析
　　3.1 giPSCs的表達(dá)差異基因的分析
　　全基因表達(dá)譜芯片分析giPSCs（GFF-giPSCs）、GFFs和阿爾巴斯白絨山羊類胚胎干細(xì)胞(ESCLCs)中差異基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，giPSCs與GFFs的表達(dá)譜有明顯的差異，與ESCLCs的表達(dá)譜也有明顯差異。giPSCs已進(jìn)入重編程，但與ESCLCs有一定差距。giPSCs中干細(xì)胞多能性

13、相關(guān)基因已開始表達(dá)，但表達(dá)量相比于ESCLCs的較低，多能性較弱。本實(shí)驗(yàn)挑選了OCT4、SOX2、 NANOG、DNMT3b、KLF5、PODXL、REX-1等20個(gè)多能性相關(guān)基因，并對(duì)比了這些基因在3組不同細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，giPSCs中多能性基因已開始表達(dá)或基因表達(dá)量明顯上調(diào)，成纖維標(biāo)志性基因明顯下調(diào)，但giPSCs中各基因的表達(dá)量低于ESCLCs中的表達(dá)。giPSCs已有多潛能特性，但相較于ESCLCs其多能性差，自我更

14、新能力較弱。
　　3.2 giPSCs的多能性和增殖相關(guān)信號(hào)通路的分析
　　對(duì)所得芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行干細(xì)胞多能性和增殖相關(guān)信號(hào)通路的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)富集性分析結(jié)果顯示，在Wnt、MAPK、PI3K-AKT、細(xì)胞周期和DNA復(fù)制等信號(hào)通路上，giPSCs的基因表達(dá)與GFFs的基因表達(dá)有顯著差異，與ESCLCs的基因表達(dá)相似。giPSCs中MAPK和PI3K-AKT信號(hào)通路具有高活性，促進(jìn)了giPSCs的多能性和自我更新。giPSCs中