生殖細(xì)胞核因子在精原干細(xì)胞體外分化中的表達(dá).pdf

1、目的：體外分離、培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞（mSSCs）；誘導(dǎo)其定向分化，檢測生殖細(xì)胞核因子（GCNF）和Oct-4在mSSCs誘導(dǎo)分化前后的表達(dá)。本研究將有助于進(jìn)一步闡明精子發(fā)生的分子機(jī)制，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)和臨床生殖醫(yī)學(xué)的諸多方面提供參考。 方法：應(yīng)用酶消化6-8天新生小鼠睪丸制備睪丸細(xì)胞懸液，以DMEM+10％胎牛血清+白血病抑制因子（LIF）+L-谷氨酰胺等為培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用堿性磷酸酶（AKP）細(xì)胞化學(xué)染色，c-Kit、oct-4和

2、GCNF間接免疫熒光對原代培養(yǎng)的mSSCs進(jìn)行鑒定；用干細(xì)胞因子（SCF）誘導(dǎo)mSSCs向精母細(xì)胞分化，通過間接免疫熒光染色和RT-PCR，檢測GCNF和Oct-4在mSSCs誘導(dǎo)分化前后的表達(dá)。 結(jié)果：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，睪丸支持細(xì)胞（Sertoli）貼壁速度較快且呈成纖維細(xì)胞樣等不規(guī)則形狀，而mSSCs貼壁速度較慢且一直呈圓形或橢圓形，核大、胞質(zhì)較少，48h后，有mSSCs克隆形成。這些mSSCs克隆具有AKP活性，c-kit和

3、Oct-4間接免疫熒光染色均呈陽性。mSSCs向精母細(xì)胞方向誘導(dǎo)2天后，Oct-4表達(dá)下調(diào)，而GCNF轉(zhuǎn)為陽性表達(dá)，上述GCNF和Oct-4間接免疫熒光染色的陽性反應(yīng)主要定位于細(xì)胞核。RT-PCR與間接免疫熒光的結(jié)果基本一致，即誘導(dǎo)2天后，Oct4表達(dá)下調(diào)，而GCNF轉(zhuǎn)為陽性表達(dá)。 結(jié)論： （1）成功建立了mSSCs的體外培養(yǎng)體系，為mSSCs的體外研究提供了一種便捷的方法。 （2）首次觀察到GCNF在體外培養(yǎng)m

4、SSCs向精母細(xì)胞分化的早期有表達(dá)，且GCNF的表達(dá)與Oct-4基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示GCNF可能參與了SSCs的早期分化，GCNF可能是通過抑制了Oct-4的表達(dá)參與SSCs分化。 （3）本研究結(jié)果顯示，GCNF在體外培養(yǎng)的mSSCs中表達(dá)為陰性，當(dāng)誘導(dǎo)其分化后GCNF開始表達(dá)，提示GCNF的表達(dá)可作為鑒別mSSCs是否分化的標(biāo)志。 （4）GCNF在mSSCs定向分化中可能發(fā)揮的作用以及mSSCs的分化機(jī)制有待于進(jìn)一