臍帶基質(zhì)干細(xì)胞在不同誘導(dǎo)條件下向生殖細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、目的：1.建立分離培養(yǎng)臍帶基質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord matrix stem cells，UC-MSCs)的方法，了解其生物學(xué)特性及分化潛能。2.探討體外微環(huán)境對UC-MSCs向生殖細(xì)胞分化的影響。3.觀察UC-MSCs移植后在小鼠早衰卵巢中的分布及生長，探討體內(nèi)微環(huán)境對UC-MSCs分化的影響。 方法：1.無菌條件下取正常足月順產(chǎn)新生兒的臍帶，用I型膠原酶消化，分離單個核細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)，獲得貼壁細(xì)胞，監(jiān)測細(xì)胞

2、生長曲線、流式細(xì)胞儀檢測其免疫表型。采用不同條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞向成脂、成骨、成肌方向分化2.采用兩種方法對UC-MSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察體外微環(huán)境對UC-MSCs分化的影響。①類胚體誘導(dǎo)：將UC-MSCs進(jìn)行懸滴培養(yǎng)，使其形成類胚體(embryonic body，EB)，進(jìn)而采用將EB與人或小鼠卵巢顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)、卵泡液培養(yǎng)等方法，體外誘導(dǎo)UC-MSCs向早期生殖細(xì)胞分化。通過RT-PCR方法檢測特異性基因的表達(dá)，免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)

3、檢測其免疫表型，觀察是否有生殖系特異性標(biāo)記物的表達(dá)。②單層細(xì)胞誘導(dǎo)：采用卵泡液作為條件培養(yǎng)基，體外誘導(dǎo)UC-MSCs向生殖細(xì)胞分化。3.通過60Coγ射線照射處理建立卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)動物模型，慢病毒介導(dǎo)綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)轉(zhuǎn)染UC-MSCs，經(jīng)尾靜脈移植于POF小鼠體內(nèi)。在不同時間點取材，通過共聚焦顯微鏡和熒光原位雜交(Fluore

4、scence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)方法檢測移植細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分布和生長情況；通過計數(shù)非閉鎖始基卵泡數(shù)目和測定雌激素水平等方法觀察卵巢的損傷修復(fù)情況。 結(jié)果：1.分離的臍帶單個核細(xì)胞培養(yǎng)后呈紡錘體樣，體外增殖達(dá)10代以上，P3代細(xì)胞中80以上處于G0/ G1期，約20％的細(xì)胞處于S+G2+M期。其分子免疫表型為：CD44、CD73、CD90、CD105陽性，CD31、CD34、CD45、HLA-

5、DR陰性，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型相似。在不同的誘導(dǎo)條件下，UC-MSCs可向成脂、成骨、成肌方向分化。2.誘導(dǎo)分化培養(yǎng)結(jié)果①將UC-MSCs進(jìn)行懸滴培養(yǎng)，其能夠形成EB。②RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EB形成后5天表達(dá)生殖系標(biāo)記物Oct-4、Ifitm-3、stella、vasa、DAZL，作為對照的UC-MSCs僅表達(dá)Oct-4、Ifitm-3、stella。③流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果：EB形成5天后，其中SSEA-1陽性細(xì)胞占15.61％

6、。④免疫組化檢測結(jié)果：形成后5天的EB與人或小鼠的卵巢顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，10天后生殖系標(biāo)記物stella、vasa、SCP3、GDF-9陽性表達(dá)，而顆粒細(xì)胞及采用卵泡液培養(yǎng)的EB均無表達(dá)。⑤單層細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)：UC-MSCs用含5％卵泡液培養(yǎng)基誘導(dǎo)20天后，細(xì)胞卷曲形成類組織樣團塊，團塊周邊不斷有懸浮細(xì)胞生成并隨之脫落，未檢測到生殖系特異性標(biāo)記物的表達(dá)。3.①60Coγ射線處理后病理切片提示：小鼠短期內(nèi)即出現(xiàn)卵巢儲備下降、卵泡閉鎖、卵巢萎縮

7、等POF樣病變，大腦、肝臟、肺臟、腎臟、心臟、脾臟、腸道、骨髓等組織未見明顯病理損傷，說明模型構(gòu)建成功。②慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染UC-MSCs的效率達(dá)80％以上；UC-MSCs經(jīng)尾靜脈移植后，在受損小鼠卵巢中可發(fā)現(xiàn)大量GFP陽性細(xì)胞存活生長，但在大腦、肝臟、肺臟、腎臟、心臟、脾臟、脊髓、腸道等組織中均未發(fā)現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞存在。③卵泡計數(shù)和雌激素測定均提示移植UC-MSCs組小鼠卵巢損傷修復(fù)情況比沒有移植UC-MSCs組小鼠修復(fù)情況好。

8、 結(jié)論：1.人UC-MSCs可在體外培養(yǎng)、擴增，細(xì)胞免疫表型與BM-MSCs相似，具有成脂、成骨、成肌等多向分化潛能，是一種理想的成體干細(xì)胞來源。2.UC-MSC體外懸滴培養(yǎng)可形成EB，與人或小鼠卵巢顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)后均表達(dá)生殖系標(biāo)記物，提示體外微環(huán)境對UC-MSCs向生殖細(xì)胞方向分化發(fā)揮十分重要的作用。3.UC-MSCs移植后能夠遷移至功能早衰卵巢并存活生長，卵泡計數(shù)和E2水平提示UC-MSCs可能具有卵巢損傷修復(fù)作用，表明體內(nèi)微環(huán)