精原干細胞體外基因轉染及其移植的初步研究.pdf

1、揚州大學碩士學位論文精原干細胞體外基因轉染及其移植的初步研究姓名：陳芳申請學位級別：碩士專業(yè)：動物學指導教師：邢華李厚達20090601揚州大學碩士學位論文II結果：QSSCs的分離、純化和培養(yǎng)：78日齡是用于小鼠SSCs分離的最佳年齡段，4—45月齡是用于犬SSCs分離研究的最佳年齡段；采用029／L膠原酶025％胰蛋白酶復合酶消化法消化生精上皮，小鼠和犬SSCs活率分別達至1J9773％和9581％；所獲得的SSCs經差速貼壁法純化

2、后純化率為6078％(小鼠)和5086％(犬)；將純化后的SSCs培養(yǎng)于支持細胞飼養(yǎng)層上，SSCs貼壁時間為培養(yǎng)8h12h，SSCs呈扁平圓形或卵圓形，大小均一，單個散在或多個成團、鏈狀存在。②SSCs的體外基因轉染：磷酸鈣法、陽離子聚合物法(含血清體系)和陽離子聚合物法(無血清體系)均可將外源EGFP基因導入SSCs中，并能表達綠色熒光蛋白。磷酸鈣法對小鼠和犬SSCs的轉染率分別為812％和796％；陽離子聚合物法(含血清體系)對小鼠

3、和犬SSCs的轉染率分別為2214％和2369％；陽離子聚合物法(無血清體系)對小鼠和犬SSCs的轉染率分別為2158％和2401％。③白消安對內源性SSCs的消除：根據動物的健康存活狀態(tài)及睪丸組織學結構變化等，確定40mg／kg的注射劑量是消除小鼠內源性SSCs的有效劑量；12mg／kg的注射劑量是消除犬內源性生精細胞的有效劑量：④轉EGFP基因SSCs的移植結果：小鼠于移植后1w、2w和3w的睪丸冰凍切片上觀察到熒光，受體睪丸基因組

4、DNA經PCR擴增后，擴增出]“620bp的特異性條帶；犬于移植后在冰凍切片上未見熒光，受體睪丸基因組DNA經PCR擴增后，未觀察到特異性條帶。結論：本實驗成功有效地分離培養(yǎng)了小鼠和犬的精原干細胞，在體外成功地將外源EGFP基因轉染Nd鼠和犬的SSCsl為，并將轉基因SSCs移植到無精子癥動物模型的睪丸內，在移植后1w、2w和3w的小鼠睪丸冰凍切片上可見熒光，提示有EGFP基因的表達。上述實驗為為利用轉基因SSCs移植法制備轉基因犬奠定