EGF基因轉(zhuǎn)染人脂肪干細(xì)胞體外誘導(dǎo)表皮細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、皮膚組織的缺損是整形和燒傷外科中常見的問題，多發(fā)生于燒傷、瘢痕或腫瘤切除后以及外傷性皮膚缺損、全身性疾患導(dǎo)致的皮膚慢性潰瘍等情況。對(duì)于較淺的燒傷創(chuàng)面或小面積的皮膚全層缺損，可以通過殘存皮膚附件的干細(xì)胞再生或臨近皮膚的上皮細(xì)胞遷移而愈合。對(duì)于較深的創(chuàng)面如Ⅲ度燒傷創(chuàng)面或大面積的皮膚全層缺損，需要采用自體皮膚或人工組織工程化皮膚進(jìn)行修復(fù)。臨床常用的修復(fù)方法存在著許多缺點(diǎn)，如造成供區(qū)的損傷，大面積燒傷患者缺乏足夠的自體皮膚，而異體皮移植存在免疫

2、排斥反應(yīng)。目前應(yīng)用于臨床的皮膚組織工程產(chǎn)品仍存在一定的免疫排斥反應(yīng)，治療效果欠佳。瘢痕的形成及嚴(yán)重程度和創(chuàng)面修復(fù)的時(shí)間關(guān)系密切，創(chuàng)面愈合時(shí)間越長(zhǎng)，膠原沉積越多，導(dǎo)致形成的瘢痕越嚴(yán)重并影響局部的功能。因此如何能夠快速覆蓋并修復(fù)創(chuàng)面，在臨床上具有重要的研究?jī)r(jià)值和治療前景。 近年來干細(xì)胞的研究為解決這一難題提供了新的的思路和可能手段。干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。它們?cè)谝欢l件下，可以分化成各種類型細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞的研究和應(yīng)用

3、受到倫理學(xué)方面限制，因而成體干細(xì)胞的研究便受到人們的高度重視。不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有多分化潛能，體外或體內(nèi)可以分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪、血管內(nèi)皮、肝臟、胰腺、神經(jīng)及上皮等多種組織細(xì)胞。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可通過抽取自體骨髓分離得到，但對(duì)病人造成創(chuàng)傷較大。近年來研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中存在一群類似骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成體干細(xì)胞。其多向誘導(dǎo)的能力和基因轉(zhuǎn)染的效率和MSCs沒有明顯的區(qū)別，而脂肪來源的干細(xì)胞(ADSCs)具有以

4、下優(yōu)勢(shì)：不需要大量的特殊血清擴(kuò)增、供區(qū)損傷很少且可以分離大量的干細(xì)胞。目前沒有將ADSCs向表皮細(xì)胞分化的研究報(bào)道。本研究首先從人脂肪抽吸物中分離培養(yǎng)ADSCs，實(shí)現(xiàn)其體外長(zhǎng)期傳代及大量擴(kuò)增。并對(duì)其增殖情況、細(xì)胞周期及染色體情況進(jìn)行分析。同時(shí)檢測(cè)了CD90、CD44、CD45、CD71、CD16、CD30、CD34、CD29、CD3、CD11b、CD133和CD19等表面分子的表達(dá)，其中CD90、CD29和CD71表達(dá)陽性。然后體外在誘

5、導(dǎo)培養(yǎng)基的條件下誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有少量細(xì)胞誘導(dǎo)后形態(tài)發(fā)生改變，呈鋪路石樣改變，角蛋白k19表達(dá)陽性，說明ADSCs在一定的誘導(dǎo)條件可以向表皮細(xì)胞分化。 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)是由體內(nèi)多種細(xì)胞分泌的一種多肽類物質(zhì)，為有絲分裂刺激原，可以加快細(xì)胞分裂，促進(jìn)增殖，還可以改變細(xì)胞的趨化性，增加細(xì)胞遷移。EGF在創(chuàng)面修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。大量的動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)表明，EGF具有明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合并提高皮膚修復(fù)質(zhì)量的

6、作用，其機(jī)制可能為：①促進(jìn)創(chuàng)緣臨近組織上皮細(xì)胞的遷移、分化及增殖。②可以增加創(chuàng)面內(nèi)膠原和細(xì)胞內(nèi)DNA含量。③促進(jìn)較淺創(chuàng)面殘存的表皮干細(xì)胞增殖、分化，或通過趨化臨近組織中間充質(zhì)干細(xì)胞向創(chuàng)面組織遷移并誘導(dǎo)其向表皮細(xì)胞分化。其應(yīng)用形式可以為局部應(yīng)用或采用基因治療的方式進(jìn)行。 將EGF基因?qū)肽繕?biāo)細(xì)胞可以采用質(zhì)粒、病毒載體等方式，而其中以AdEasy腺病毒重組系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛，其具有以下優(yōu)勢(shì)：①宿主范圍廣，對(duì)人致病性低。②可以在增殖和非

7、增殖細(xì)胞中感染并表達(dá)目的基因，而逆轉(zhuǎn)錄病毒由于只能感染增殖性細(xì)胞，DNA轉(zhuǎn)染不能在非增殖細(xì)胞中進(jìn)行，而必須使細(xì)胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)。③能有效進(jìn)行增殖，產(chǎn)生的病毒滴度較高。④無需輔助病毒，可容納7.5kb外源DNA，且與人類基因同源。⑤不整合到宿主細(xì)胞染色體中，無插入致突變性。⑥能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因?；诖?，我們首次報(bào)道將EGF基因成功導(dǎo)入腺病毒載體，并經(jīng)過酶切和測(cè)序鑒定構(gòu)建的腺病毒載體中含有完整的EGF基因。測(cè)定病毒滴度為4.4×108PF

8、U/ml，可以滿足基因治療的需要。 將Ad-EGF轉(zhuǎn)染人ADSCs實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在病毒液為MOI=50轉(zhuǎn)染ADSCs，48小時(shí)后感染效率高達(dá)90％，說明ADSCs可以作為基因治療的良好靶細(xì)胞。對(duì)轉(zhuǎn)染EGF基因的ADSCs第四代染色體分析無突變，并對(duì)其增殖特性進(jìn)行檢測(cè)，與未轉(zhuǎn)染的ADSCs相比生長(zhǎng)增殖情況無差異性。同時(shí)RT-PCR檢測(cè)到培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染ADSCs細(xì)胞中有EGF基因的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附方法對(duì)轉(zhuǎn)基因的ADSCs體外培養(yǎng)24h、

9、48h、72h、96h、120h的細(xì)胞上清液中EGF蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明與未轉(zhuǎn)染的ADSCs比較，轉(zhuǎn)EGF的ADSCs可以持續(xù)分泌一定水平的EGF蛋白。結(jié)果表明成功的構(gòu)建了含EGF基因的腺病毒載體并高效傳染ADSCs，使后者能持續(xù)分泌EGF從而發(fā)揮其生物作用。 盡管轉(zhuǎn)EGF基因的ADSCs直接應(yīng)用應(yīng)該能夠促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，但為了更有效的修復(fù)創(chuàng)面，將轉(zhuǎn)EGF的ADSCs在體外一定的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下向表皮細(xì)胞分化。體外誘導(dǎo)7d

10、后，約43.3％細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，呈不規(guī)則形，并有少許突起，免疫組化檢測(cè)有角蛋白K19的表達(dá)，與未轉(zhuǎn)基因的ADSCs比較陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多。說明轉(zhuǎn)基因的ADSCs在體外一定條件下可以向表皮細(xì)胞分化，轉(zhuǎn)EGF基因不影響ADSCs的體外分化相反能促進(jìn)其分化。 進(jìn)一步將誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)EGF基因ADSCs移植于裸鼠皮膚缺損模型，對(duì)創(chuàng)面修復(fù)面積及修復(fù)后組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組1、對(duì)照組2和空白組比較，修復(fù)的速度明顯加快，形成的新生表皮