干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為類毛細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、第一部分神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記 目的：神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的研究已逐漸成為國內(nèi)、外基礎(chǔ)及臨床醫(yī)學(xué)各專業(yè)的重要研究課題。利用NSC進(jìn)行細(xì)胞治療或基因治療有很好的臨床應(yīng)用前景。本實驗旨在建立一種較為簡便、可靠的豚鼠NSC分離、培養(yǎng)、標(biāo)記方法，為耳科學(xué)領(lǐng)域NSC的進(jìn)一步深入研究提供幫助。 材料與方法：分離新生豚鼠海馬組織進(jìn)行NSC的原代、傳代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征，培養(yǎng)的細(xì)胞行Nest

2、in免疫細(xì)胞化學(xué),WesternBlot檢測，對誘導(dǎo)細(xì)胞行NSE、GFAP免疫熒光化學(xué)觀察，以鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為NSC；用熒光染料DAPI標(biāo)記干細(xì)胞，計算原代及傳代標(biāo)記率。 結(jié)果：1.原代培養(yǎng)見細(xì)胞呈大小不一、懸浮生長的細(xì)胞團(tuán)，邊界清晰，細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞排列較為致密。光鏡下傳代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)特點與原代培養(yǎng)無明顯差異。2．原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)Nestin陽性表達(dá)，誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞NSE、GFAP陽性表達(dá)。3.經(jīng)熒光染料DAPI標(biāo)記后

3、，標(biāo)記成功率可達(dá)93.4％，經(jīng)傳代8次后熒光標(biāo)記可傳入子代細(xì)胞，其熒光亮度無明顯衰減。 結(jié)論：1．本研究從新生豚鼠海馬組織中分離、培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs。2．DAPI標(biāo)記活細(xì)胞具有對細(xì)胞損傷小，標(biāo)記效率高，可長期觀察的優(yōu)點。 第二部分人工外淋巴液誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的分化 目的：本研究使用不同濃度的人工外淋巴液體外模擬內(nèi)耳微環(huán)境誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化，以期為進(jìn)一步研究和使用神經(jīng)干細(xì)胞移植內(nèi)耳奠定基礎(chǔ)。 結(jié)論：1.神經(jīng)

4、干細(xì)胞在胎牛血清和人工外淋巴液中均可以存活并分化出表達(dá)毛細(xì)胞特異抗體的細(xì)胞。2．鼠尾膠原有利于神經(jīng)干細(xì)胞向類毛細(xì)胞分化。 第三部分不同配方生長因子對神經(jīng)干細(xì)胞分化為類毛細(xì)胞的影響 目的：本研究以新生豚鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞為對象，探討由堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)及腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)所組成的不同配方對誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響，旨在尋求最適合神經(jīng)干細(xì)胞向類毛細(xì)胞方向分化的培養(yǎng)條件。

5、 結(jié)論：bFGF、EGF、BDNF均能誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向類毛細(xì)胞方向分化，但以bFGF+EGF及bFGF+EGF+BDNF協(xié)同作用為佳。 第四部分豚鼠脂肪干細(xì)胞向類毛細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 目的：本研究進(jìn)一步完善了豚鼠脂肪干細(xì)胞(ADSCs)分離方法，并對脂肪干細(xì)胞體外加以誘導(dǎo)分化為類毛細(xì)胞，希望為下一步脂肪干細(xì)胞移植入內(nèi)耳提供理論依據(jù)。 結(jié)果：1．豚鼠脂肪干細(xì)胞呈現(xiàn)梭形或多角形生長。2．MTT檢測表明培養(yǎng)的ADSCs具