同源盒基因HOXA4轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)表皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 本課題旨在構(gòu)建攜帶同源基因HOXA4的慢病毒表達(dá)載體，體外觀察轉(zhuǎn)染HOXA4基因后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilicalcord mesenchymal stemcells hUCMSCs)的生物學(xué)特性及定向分化為表皮細(xì)胞的能力。為皮膚缺損及燒傷疾病的細(xì)胞治療及基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、使用酶切及PCR技術(shù)從克隆模版HOXA4-MSCV逆轉(zhuǎn)錄載體中獲取目的基因HO

2、XA4，并將HOXA4基因重組到慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒plenti-GFP-CTB上，通過(guò)酶切、測(cè)序驗(yàn)證HOXA4基因序列無(wú)誤后，將plenti-GFP-HOXA4質(zhì)粒、輔助包裝質(zhì)粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、PMD2G共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞，獲得攜帶HOXA4基因的重組慢病毒Lentil-GFP-HOXA4。
　　 2、將獲取的慢病毒液感染hUCMSCs48h后，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染后的細(xì)胞形態(tài)

3、改變、綠色熒光表達(dá)(GFP)強(qiáng)弱，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其GFP表達(dá)效率。利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法在基因水平上檢測(cè)HOXA4在hUCMSCs中的表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因hUCMSCs細(xì)胞周期。
　　 3、在體外培養(yǎng)條件下，不添加任何誘導(dǎo)因子，將HOXA4基因修飾的hUCMSCs培養(yǎng)誘導(dǎo)分化21d，細(xì)胞免疫組化檢測(cè)特異性表皮細(xì)胞分子標(biāo)志CK18、CK19、人廣譜角蛋白的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CK14、CK18的表

4、達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)含有HOXA4的質(zhì)粒模版進(jìn)行擴(kuò)增，成功獲取了HOXA4基因，Plenti-GFP-載體成功酶切線性化。細(xì)菌陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定證明，重組質(zhì)粒plenti-GFP-HOXA4構(gòu)建成功并能在感受態(tài)大腸桿菌中大量擴(kuò)增；測(cè)序結(jié)果顯示，plenti-GFP-HOXA4中HOXA4與質(zhì)?？寺∧０嬷行蛄型耆恢?。慢病毒載體plenti-GFP-HOXA4轉(zhuǎn)染293T。細(xì)胞，72h后應(yīng)用

5、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在接近1kb處觀察到有目的條帶(目的條帶為936bp)，顯示HOXA4基因表達(dá)。在熒光顯微鏡下可觀察到通過(guò)慢病毒載體系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中有綠色熒光蛋白的表達(dá)，說(shuō)明病毒包裝成功。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定plenti-GFP-HOXA4的病毒滴度為2.11×108TU/ml。
　　 2.基因轉(zhuǎn)染hUCMSCs48h后觀察到較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)，當(dāng)病毒感染復(fù)數(shù)(muhiplicities of infectio

6、n MOI)值為60時(shí)pLenti-GFP-HOXA4及pLenti-GFP的轉(zhuǎn)染率均達(dá)到90％以上，RT-PCR檢測(cè)到目的基因HOXA4在hUCMSCs中表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示80％以上轉(zhuǎn)染基因的hUCMSCs處于G0和G1期，增殖能力未受明顯影響。
　　 3.將HOXA4基因修飾的hUCMSCs在單層培養(yǎng)條件下，體外誘導(dǎo)7d后，少量細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由長(zhǎng)梭性變?yōu)椴灰?guī)則形，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多。到14d細(xì)胞形態(tài)改變更明顯，呈聚集生長(zhǎng)

7、，并出現(xiàn)多個(gè)突起，在21d左右，通過(guò)流式細(xì)胞儀及免疫組化測(cè)到角蛋白14、19，18、人廣譜角蛋白均有表達(dá)，與未轉(zhuǎn)染基因的hUCMSCs比較陽(yáng)性細(xì)胞比率明顯增多，說(shuō)明轉(zhuǎn)染HOXA4基因不影響hUCMSCs的體外活性且轉(zhuǎn)基因的hUCMSCs在體外一定條件下可以向表皮細(xì)胞分化。
　　 結(jié)論：
　　 1、HOXA4基因慢病毒載體構(gòu)建成功。
　　 2、hUCMSCs在體外易于被外源基因修飾，且對(duì)其增殖分化無(wú)影響。