轉(zhuǎn)染HOXB4基因的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增人臍血CD34+細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定表達(dá)人同源盒基因(Homeobox Gene) HOXB4的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)層，探討直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因與以轉(zhuǎn)染HOXB4基因的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層對(duì)人臍血CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增的不同，包括對(duì)有核細(xì)胞數(shù)、CD34+細(xì)胞比例與擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞周期及集落形成能力等干細(xì)胞特征的比較。
　　 方法：將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSC)分為兩組，一組利用慢病毒載體將HOXB4基因轉(zhuǎn)染至HUCMSC(HOXB4-H

2、UCMSC)，一組為未轉(zhuǎn)染的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSC)，兩組細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C（MMC）處理后作為飼養(yǎng)層細(xì)胞備用。應(yīng)用免疫磁珠分選系統(tǒng)(magnetic activated cell sorting，MACS)分選人臍血CD34+細(xì)胞，在含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后分5組，其中包括對(duì)照組2組:A組CD34+細(xì)胞為空白對(duì)照組;B組以轉(zhuǎn)染空病毒的CD34+細(xì)胞為陰性對(duì)照組;實(shí)驗(yàn)組共3組:直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因的CD34+細(xì)胞為C組

3、;以HUCMSC為滋養(yǎng)層的CD34+細(xì)胞為D組;以HOXB4-HUCMSC為滋養(yǎng)層的CD34+細(xì)胞為E組。培養(yǎng)第6、10、14天計(jì)數(shù)并比較各組的有核細(xì)胞數(shù)(NC)，并于第10天比較不同處理?xiàng)l件對(duì)CD34+細(xì)胞比例、細(xì)胞周期與集落形成能力的影響。
　　 結(jié)果：利用慢病毒載體可將HOXB4基因轉(zhuǎn)染至HUCMSC并檢測(cè)到HOXB4在mRNA水平上的表達(dá)，應(yīng)用濃度為10μ g/ml的絲裂霉素C建立HUCMSC與HOXB4-HUCMSC滋

4、養(yǎng)層，并檢測(cè)到目的基因在mRNA水平上的表達(dá)。應(yīng)用免疫磁珠分選技術(shù)成功分選出人臍血CD34+細(xì)胞，純度達(dá)87％。經(jīng)過(guò)14天體外培養(yǎng)，5組的有核細(xì)胞(NC)均得到顯著擴(kuò)增，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因組、HUCMSC滋養(yǎng)層組、HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組兩對(duì)照組擴(kuò)增倍數(shù)依次為:(109.07±14.38)、(119.23±14.61)、(359.90±25.05)、(250.20±22.68)、(401.90±21.

5、51)，經(jīng)比較:HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組＞直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因組＞HUCMSC滋養(yǎng)層組＞兩對(duì)照組，p＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外擴(kuò)增第10天檢測(cè)5組有核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞比例均大幅下降，經(jīng)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)較第0天顯著擴(kuò)增，比較CD34+細(xì)胞比例與擴(kuò)增倍數(shù)均為直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因組＞HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組＞HUCMSC滋養(yǎng)層組＞兩對(duì)照組，p＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周

6、期，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的S+G2/M比例高，其中HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組比例最高為41.57％，高于直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因的37.87％與HUCMSC的滋養(yǎng)層組的28.65％，p＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組與直接轉(zhuǎn)HOXB4基因組的集落形成能力無(wú)差別，但二者均高于HUCMSC滋養(yǎng)層組與對(duì)照組。
　　 結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)成功建立轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染HOXB4基因的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)層;(2)采用免