臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增研究及其分泌細(xì)胞因子的高通量篩查.pdf

1、研究背景：間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)也稱為多潛能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞,為一種非造血成體干細(xì)胞,在組織中分布廣泛,具有自我更新和多向分化能力。由于具有免疫調(diào)節(jié)、多向分化潛能、易于獲取、體外增殖快、凍存后活性損失小、免疫原性低并且無倫理問題及毒副作用等特點(diǎn)已經(jīng)在臨床上被廣泛用于多種疾病的治療性研究。成體骨髓來源的MSCs(Bonemarrow-derivedMSCs,BM-MSCs)是研究最早且較為深入的M

2、SCs,但由于抽取骨髓對供者損傷較大、易受病毒感染、細(xì)胞數(shù)量和增殖/分化能力隨年齡顯著下降等原因限制了BM-MSCs的臨床應(yīng)用。大量研究已表明,多種組織均含有MSCs,如臍帶(Umbilicalcord,UC)、脂肪等。而臍帶作為胎兒娩出后的醫(yī)療廢棄物,具有易于獲取、倫理限制小、體外易于擴(kuò)增及培養(yǎng)等優(yōu)勢。因此,本實(shí)驗(yàn)擬對臍帶來源的MSCs(UC-derivedMSCs,UC-MSCs)與成人BM-MSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行比較,以期望獲得

3、更佳的MSCs種子細(xì)胞來源。同時(shí),許多研究均表明,MSCs分泌的細(xì)胞因子在MSCs治療效應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,但目前尚無UC-MSCs細(xì)胞因子表達(dá)譜的研究報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)擬采用細(xì)胞因子抗體芯片對不同代次UC-MSCs分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行高通量篩選,為UC-MSCs傳代次數(shù)的確定并為后續(xù)治療機(jī)制的研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：在MSCs臨床應(yīng)用中,為種子細(xì)胞來源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù);我們比較了體外分離培養(yǎng)UC-和BM-MSCs在形態(tài)特征、

4、增殖能力、表面標(biāo)志和誘導(dǎo)分化能力等方面的差異;為給體外長期培養(yǎng)UC-MSCs的穩(wěn)定性提供實(shí)驗(yàn)證據(jù),我們進(jìn)一步研究了體外長期培養(yǎng)UC-MSCs的生物特性及活性變化等特點(diǎn);為了確定體外培養(yǎng)UC-MSCs的較佳傳代次數(shù)并為治療機(jī)制提供一定的理論依據(jù),我們對不同代次的UC-MSCs體外分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行細(xì)胞因子抗體芯片篩查和表達(dá)譜的差異比較。
　　方法：我們分別應(yīng)用酶消化法和密度梯度離心法分離UC-MSCs和BM-MSCs,并用貼壁培養(yǎng)方

5、法進(jìn)一步純化兩種來源MSCs。采用顯微鏡技術(shù)觀察比較了兩者的形態(tài)特點(diǎn);應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測了兩者的增殖能力;通過體外連續(xù)傳代試驗(yàn)研究兩者的傳代能力;采用流式細(xì)胞術(shù)分析了兩者免疫表型;通過染色法鑒定比較體外誘導(dǎo)UC-和BM-MSCs向脂肪、軟骨和成骨細(xì)胞分化能力。我們進(jìn)一步對UC-MSCs進(jìn)行體外連續(xù)培養(yǎng),檢測了細(xì)胞生物特性和功能,并采用細(xì)胞因子抗體芯片對不同
　　代次UC-MSCs的上清液進(jìn)行了高通量篩查(目標(biāo)蛋白為174種細(xì)胞因子

6、,RayBio?),根據(jù)熒光強(qiáng)度信號(hào)情況,篩選出MSCs上清液中陽性表達(dá)的細(xì)胞因子,并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析不同代次UC-MSCs間的分泌陽性細(xì)胞因子的信號(hào)差異。
　　結(jié)果：細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示,UC-和BM-MSCs細(xì)胞形態(tài)相似,均表現(xiàn)為長梭型、貼壁生長;體外長期傳代試驗(yàn)表明,BM-MSCs體外增殖能力較差,傳代至9～10代基本失去增殖能力,而UC-MSCs增殖及更新能力明顯強(qiáng)于BM-MSCs,傳至15代時(shí)仍保持原有的特性;細(xì)胞表型結(jié)果

7、表明,UC-和BM-MSCs具有均一的免疫表型:不表達(dá)造血和內(nèi)皮標(biāo)志CD34、CD45、CD11b、CD31以及免疫共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ類分子(HLA-DR),表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD44、CD105和CD166和CD73。但BM-MSCs的CD80顯著高于UC-MSCs的(P=0.0137);誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示,UC-和BM-MSCs均可向脂肪、成骨和軟骨三系分化;細(xì)胞因子抗體芯片檢測結(jié)果表明,UC-MSCs上清液中陽性分

8、泌的細(xì)胞因子有102種(強(qiáng)陽性34種,一般陽性68種),主要涉及促細(xì)胞遷移類(24.5％)、受體類(20.6%)、促細(xì)胞生長和分化類(20.6%)和免疫調(diào)節(jié)類(12.7%);統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,第3、5和9代UC-MSCs分泌的細(xì)胞因子有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的只有11種:TNF-beta(P=0.0147)、IL-12p70(P=0.0265)、MSP-alpha(P=0.0289)、HCC-4/CCL16(P=0.027)、IP-10/CXC

9、L10(P=0.0202)、GITR(P=0.024)、PDGFRalpha(P=0.0277)、VEGFR2(P=0.038)、IL-9(P=0.0291)、MIP-1beta/CCL4(P=0.0497)和CNTF(P=0.0073)。
　　結(jié)論：UC-MSCs能替代BM-MSCs作為臨床上MSCs的種子細(xì)胞;不同代次UC-MSCs分泌的絕大多數(shù)細(xì)胞因子水平無差異;蛋白芯片能以極小的樣本量檢測高通量的細(xì)胞因子,是篩查MSCs細(xì)