Endostatin基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人臍帶血CD34+造血干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:將人血管內(nèi)皮抑制素Endostatin轉(zhuǎn)導(dǎo)人臍帶血CD34+造血干細(xì)胞厲分析其表達(dá)和分泌情況.方法:利用逆轉(zhuǎn)錄病毒plncx做載體,將plncx-endostatin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌,用氨芐青霉素(AMP)進(jìn)行篩選,小劑量培養(yǎng)擴(kuò)增,用堿裂解法回收后,用HindⅢ和ClaⅠ雙酶切鑒定.用電擊穿孔法(electroporation)將重組質(zhì)粒plncx-Endostatin轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞PA317,用G418進(jìn)行篩選獲得轉(zhuǎn)

2、導(dǎo)成功的PA317細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng),提取病毒上清并劇NIH3T3檢測(cè)濃度.取新鮮人臍帶血40~80ml用Ficoll分離出單個(gè)核細(xì)胞,再用免疫磁珠(MiniMACS)進(jìn)一步分離出CD34+造血干細(xì)胞.將病毒上清與人臍帶血CD34+造血干細(xì)胞共培養(yǎng)72小時(shí).應(yīng)用PCR及Westernbolt檢測(cè)人Endostatin在臍帶血造血干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)和分泌.結(jié)果:plncx-endo質(zhì)粒在DH5 a大腸桿菌中克隆擴(kuò)增后,經(jīng)酶切鑒定有endos

3、tatin基因存在.流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè),CD34+干細(xì)胞在臍血中的初始含量<5％,經(jīng)Mini-MACS分離純化,純度超過(guò)90％.從1×10<'8>的界面細(xì)胞,平均可以分離獲得(5~20)×10<'5>CD34+干細(xì)胞.電穿孔介導(dǎo)重組基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人臍帶血CD34+造血干細(xì)胞后,經(jīng)PCR證實(shí),轉(zhuǎn)導(dǎo)Endostatin基因的人臍帶血CD34+造血干細(xì)胞基因組中存在有550bp Endostatin人特異性片段,Westernbolt分析示人

4、Endostatin在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)和分泌.結(jié)論:1.電穿孔可有效地介導(dǎo)重組基因的轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高,安全無(wú)副作用,操作簡(jiǎn)單.2.PA317細(xì)胞能有效地為逆轉(zhuǎn)錄病毒提供包裝蛋白,使之成為完整的病毒顆粒,并能用G418對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的包裝細(xì)胞進(jìn)行篩選.3.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度達(dá)10<'6>以上,能有效感染靶細(xì)胞.4.經(jīng)病毒上清感染后,CD34+/endo細(xì)胞能高表達(dá)endostatin基因,合成endostatin蛋白.輸入CD34+/end