2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
   1.在體外建立臍血CD34+細(xì)胞向自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK細(xì)胞)誘導(dǎo)分化體系,并研究不同的細(xì)胞因子組合對(duì)NK細(xì)胞表型、分化機(jī)制、增殖、殺傷活性的影響。
   2.探討rhIL-15在CD34+細(xì)胞向NK細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用及相關(guān)機(jī)制。
   方法:
   1.純化臍血來(lái)源的CD34+細(xì)胞取臍靜脈血稀釋后,用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法收集臍血單個(gè)核細(xì)胞(

2、cord blood-mononuclear cell,CB-MNC)。利用MACS富集CB-MNC內(nèi)的CD34+細(xì)胞備用,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度。
   2.建立CD34+細(xì)胞向NK細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系將純化的臍血來(lái)源CD34+細(xì)胞以1×105/ml的起始密度接種于24孔板,每孔加入1ml完全RPMI1640培養(yǎng)基(含10%熱滅活的胎牛血清,10-6mol/LHDC)。根據(jù)加入細(xì)胞因子的不同,實(shí)驗(yàn)分為3組:A組(SCF+FLT-3L

3、+IL-2+IL-7+IL-15)、B組(SCF+FLT-3L+IL-2+IL-7)、C組(SCF+FLT-3L+IL-7)。C組細(xì)胞培養(yǎng)3周后分為C1、C2、C3三組,相應(yīng)加入IL-2、IL-15、IL-2+IL-15繼續(xù)誘導(dǎo)分化2周,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。所用細(xì)胞因子濃度為SCF20ng/ml、FLT-3L10ng/ml、IL-2500U/ml、IL-720ng/ml、IL-1510ng/ml。置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

4、5周,每3-4天半量換液,全量補(bǔ)充細(xì)胞因子。
   3.細(xì)胞增殖和免疫表型分析每周以細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞免疫表型。檢測(cè)指標(biāo)如下:A、B兩組中CD3-CD56+NK細(xì)胞的比例;C組中CD34brightCD122+NK祖細(xì)胞的比例;C1、C2、C3組中NK細(xì)胞的比例。
   4.CCK-8法檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)對(duì)象為:誘導(dǎo)分化5周的A、B組NK細(xì)胞和臍血活化的NK細(xì)胞。活化的NK細(xì)胞由臍血單個(gè)核細(xì)

5、胞經(jīng)IL-2500U/ml和IL-1510ng/ml刺激2周獲得,用來(lái)與誘導(dǎo)分化NK細(xì)胞的殺傷活性相比較。所用靶細(xì)胞為Hela細(xì)胞和K562細(xì)胞。
   5.real-timePCR法檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)A、B組誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞和CD34+細(xì)胞檢測(cè)腫瘤壞死因子、顆粒酶B、穿孔素、干擾素-γbcl-2、bax、STAT5A、STAT5B的表達(dá)水平。
   結(jié)果:
   1.分選前CB-MNC中CD34+細(xì)胞僅占2.

6、46%,經(jīng)過(guò)MACS分選后CD34+細(xì)胞比例到達(dá)88.7%。每份臍血可獲得(3-6)×105個(gè)CD34+細(xì)胞。
   2.根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果,A、B兩組細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)5周后,NK細(xì)胞比例分別為61.59%、17.91%;平均每個(gè)CD34+細(xì)胞可誘導(dǎo)獲得的NK細(xì)胞數(shù)分別為122個(gè)及21個(gè);共表達(dá)NKG2D受體的CD56+NK細(xì)胞比例分別為73.4%、57.5%。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明IL-15可以提高NK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效率和擴(kuò)增倍數(shù),促進(jìn)

7、NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D受體。C組細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后,NK祖細(xì)胞比例達(dá)到23.1%,分別以IL-2、IL-15、IL-2+IL-15繼續(xù)刺激2周后,C1、C2、C3組中NK細(xì)胞比例分別為7.45%、14.14%、16.83%,說(shuō)明SCF+FLT-3L+IL-7的組合能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生NK祖細(xì)胞,IL-15能夠促進(jìn)其分化發(fā)育為成熟NK細(xì)胞。
   3.殺傷實(shí)驗(yàn)中,各組細(xì)胞在效靶比為10∶1時(shí)殺傷效果最強(qiáng)。A組對(duì)K562細(xì)胞和Hela細(xì)胞的

8、殺傷率為24.7%和19.5%;B組對(duì)K562細(xì)胞和Hela細(xì)胞的殺傷率最低,分別為10.7%和8.5%。提示IL-15能夠提高NK細(xì)胞的殺傷活性。
   4.RealtimePCR結(jié)果顯示,A、B組NK細(xì)胞中腫瘤壞死因子、顆粒酶B、穿孔素、干擾素-γ表達(dá)水平較CD34+細(xì)胞明顯提高,且A組基因表達(dá)水平比B組高。說(shuō)明誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞具有分泌細(xì)胞因子的能力,IL-15能夠促進(jìn)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。A組bcl-2、STAT5A、S

9、TAT5B、bcl-2/bax=2.356表達(dá)水平較B組升高。提示IL-15可能通過(guò)JAK3-STAT5通路介導(dǎo)CD34+細(xì)胞向NK細(xì)胞分化,通過(guò)上調(diào)bcl-2表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。
   結(jié)論:
   1.臍血源CD34+細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)分化為NK細(xì)胞,最佳細(xì)胞因子組合為SCF+FLT-3L+IL-2+IL-7+IL-15。
   2.誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的NK細(xì)胞主要為CD56bright亞群,具有分泌細(xì)胞因子和殺傷腫

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