水牛精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定及轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞的異種移植.pdf

1、通過研究培養(yǎng)條件（包括血清濃度、飼養(yǎng)層細(xì)胞及三種生長因子）對水牛精原干細(xì)胞(SSCs)增殖的影響，最終建立水牛SSCs體外增殖的培養(yǎng)體系。通過介導(dǎo)生長抑素RNA干擾的PB轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染SSCs，得到含目的基因片段的SSCs;在移植轉(zhuǎn)基因SSCs至昆明鼠睪丸后，分析轉(zhuǎn)基因SSCs的增殖與分化功能。該研究為克隆轉(zhuǎn)基因水牛提供新途徑;為SSCs的生物學(xué)特性、多潛能性及定向分化的表觀遺傳學(xué)和精子發(fā)生機(jī)理等研究提供技術(shù)平臺;結(jié)合SSCs的冷凍保存，為

2、水牛的種質(zhì)資源保存提供新手段;為其他家畜和人的SSCs的研究提供理論參考。
　　1.水牛精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與分子標(biāo)志探索
　　水牛SSCs特異性分子標(biāo)志的發(fā)展，體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及其多能性的保持，在水牛的選擇性遺傳修飾中具有重要的意義。本研究取4～5月齡雜交水牛（摩拉×沼澤，49條染色體）睪丸，經(jīng)Westernblot發(fā)現(xiàn)水牛睪丸中存在兩種蛋白異構(gòu)體(135kDa大片段和90kDa小片段)，CDH1為水牛精原干細(xì)胞的特異

3、性分子標(biāo)志;免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)水牛睪丸精原細(xì)胞上存在CDH1的表達(dá)，且在體細(xì)胞中無表達(dá)。純化后的精原干細(xì)胞（流式分析純化富集效率達(dá)到53％）體外培養(yǎng)7天后，CDH1在細(xì)胞克隆中也檢測到表達(dá)，。而且在精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，不同生長因子組合對增殖影響的研究發(fā)現(xiàn)，與對照或僅添加單一生長因子組相比，共同添加20ng/mLGDNF、10ng/mLFGF2和1000U/mLLIF能顯著提高水牛精原干細(xì)胞的克隆數(shù)（約提高2倍）和增殖率（約提高3

4、倍），還能顯著上調(diào)精原細(xì)胞特異性和多能性相關(guān)標(biāo)志物（BCL6B，GFRA1和POU5F1）的mRNA表達(dá)水平，同時下調(diào)受體酪氨酸激酶(KIT)。本研究結(jié)果證實水牛存在CDH1特異性分子標(biāo)志，可用于建立體外培養(yǎng)體系，從而有利于水牛的遺傳修飾。
　　2.生長抑素干擾載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞及水牛SSCs克隆
　　生長抑素(SS)在體內(nèi)的主要作用是抑制生長激素(GH)的分泌，而抑制SS的分泌則可以促進(jìn)動物的生長。如果干擾SSCs的

5、SS基因后進(jìn)行移植，可獲得長期整合的轉(zhuǎn)基因后代，從而得到生長狀況良好的優(yōu)異個體。但是，由于SSCs本身沒有SS的分泌，所以對于干擾效果的驗證需在其他SS分泌型細(xì)胞上實施。本研究設(shè)計并構(gòu)建了3條針對SS基因序列的干擾片段，以PB載體介導(dǎo)經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞（倉鼠腎成纖維細(xì)胞，經(jīng)鑒定具備分泌SS的細(xì)胞）以沉默SS基因的表達(dá)，經(jīng)過放射性免疫(RIA)和熒光定量PCR結(jié)果得知其中一個干擾載體在細(xì)胞水平的干擾效果十分明顯，可達(dá)到50％以

6、上。另外發(fā)現(xiàn)，在干擾生長抑素的表達(dá)后，BHK-21細(xì)胞的早期凋亡顯著降低，細(xì)胞更多地進(jìn)入S期。在體外干擾細(xì)胞的生長抑素表達(dá)是否影響生長抑素受體的變化目前未見報道，因此，我們檢測了生長抑素基因五個受體表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，生長抑素受體SSTR2、SSTR3的表達(dá)都下調(diào)。隨后，應(yīng)用RT-PCR和WesternBlot方法檢測與凋亡和周期相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)Caspase-3、p21的表達(dá)水平都顯著下調(diào)，而Bcl-2的表達(dá)水平則顯著上調(diào)。這些結(jié)

7、果表明，生長抑素可能通生長抑素受體2和3來調(diào)控Caspase-3與Bcl-2等基因的活動，從而促進(jìn)BHK-21細(xì)胞的凋亡。選擇干擾效果最佳的pshRNA-2質(zhì)粒并優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法后，成功轉(zhuǎn)染SSCs，轉(zhuǎn)染率達(dá)90％以上。
　　3.轉(zhuǎn)基因SSCs克隆的異種移植
　　為了確認(rèn)轉(zhuǎn)染后SSCs干細(xì)胞的潛能，通過DBA染色鑒定證實異種移植小鼠睪丸曲細(xì)精管的基底膜上存在供體水牛精原細(xì)胞。為了探討水牛精原干細(xì)胞移植到昆明小鼠后的增殖情況，首先

8、對受體動物（昆明小鼠）注射不同劑量(30，35，40mg/kg體重)的白消安，以消除內(nèi)源性精原細(xì)胞的干擾，依據(jù)體重、睪丸組織形態(tài)學(xué)和受體小鼠的睪酮激素水平綜合評判消除效果，發(fā)現(xiàn)以40mg/kg體重的劑量為最優(yōu)。之后將體外轉(zhuǎn)染的水牛SSCs克?。ǎ?8％純度）打散重懸后，經(jīng)顯微注射到小鼠曲細(xì)精管內(nèi)，在注射后1天、4天、1周、2周、3周、1個月和2個月，收集各實驗組和對照組小鼠睪丸，應(yīng)用扁豆凝集素(DBA)免疫組化和PCR方法檢測供體精原細(xì)