小鼠心肌干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)、分選與鑒定及他汀對(duì)心肌干細(xì)胞存活的研究.pdf

1、背景:
　　研究表明心臟存在干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的能力。2011年及2012年國(guó)外已開(kāi)展心肌干細(xì)胞用于急性心肌梗死及缺血性心肌病的臨床試驗(yàn)，其中SCIPIO利用c-kit陽(yáng)性心肌干細(xì)胞治療心衰，EF顯著提高;而CADUCEUS實(shí)驗(yàn)利用小球(cardiosphere)治療急性心梗，局部心肌活力改善，但左室射血分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性差異。最新的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明心肌干細(xì)胞用于治療急性心肌梗死效果優(yōu)于骨髓單個(gè)核細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。然而，心

2、肌干細(xì)胞的提取、分離、擴(kuò)增過(guò)程周期長(zhǎng)，較其他細(xì)胞更為復(fù)雜。建立成熟的細(xì)胞培養(yǎng)方法成為以后基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)的前提條件。同時(shí)，既往的研究表明，單純輸注干細(xì)胞治療心梗后心衰效果有限，這是因?yàn)榧?xì)胞駐留率不高及心肌梗死后惡劣的微環(huán)境所致。因此，提高干細(xì)胞本身的活力及改善移植后干細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境策略是近年研究的熱點(diǎn)。
　　目的:
　　1)建立從成年小鼠心臟組織中分離培養(yǎng)得到c-kit陽(yáng)性心肌干細(xì)胞的有效方法;
　　2)探索阿托伐

3、他汀對(duì)心肌干細(xì)胞在缺氧/無(wú)血清培養(yǎng)下的作用。
　　方法:
　　1)心肌干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴(kuò)增:無(wú)菌條件下取2月齡成年C57BL/6小鼠心臟，PBS洗滌，剪碎，經(jīng)胰蛋白酶和膠原酶Ⅳ消化后，置于Matrigel組織塊培養(yǎng)基(complete explant medium，CEM)中培養(yǎng)。大約2周后，收集心肌組織旁爬出成纖維狀細(xì)胞板層上的小、圓、亮的細(xì)胞，接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，予以心球生長(zhǎng)培養(yǎng)基（cardiosphere

4、-growing medium，CGM）繼續(xù)培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增后再通過(guò)磁珠分選收集純化的c-kit陽(yáng)性心肌干細(xì)胞。分選前及分選后用流式細(xì)胞儀分析所得細(xì)胞其表面抗體c-kit和sca-1的表達(dá)。2）他汀對(duì)缺氧/無(wú)血清心肌干細(xì)胞的作用:分選后的心肌干細(xì)胞置于含不同濃度他汀(對(duì)照組，10-3-μ mol/l,10-2μ mol/l，10-1μ mol/l，1μ mol/l，10μ mol/l)的無(wú)血清心球生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在缺氧12小時(shí)后觀察細(xì)胞形態(tài)

5、的變化，用流式細(xì)胞法分析細(xì)胞凋亡比例。
　　結(jié)果:
　　1)心肌干細(xì)胞培養(yǎng):消化后的心肌組織3天后可見(jiàn)成纖維樣細(xì)胞從組織塊兒周圍爬出，1周后可見(jiàn)小、圓、亮的細(xì)胞出現(xiàn)在組織塊周圍爬出的成纖維細(xì)胞層上。傳代培養(yǎng)后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)呈較均一的梭型，可見(jiàn)心肌干細(xì)胞形成的“太陽(yáng)狀”集落。磁珠分選可獲得分選前大約1％的細(xì)胞。流式細(xì)胞分析磁珠分選后c-kit陽(yáng)性率為18.59％，sca-1陽(yáng)性率為56.7％;而分選前c-kit陽(yáng)性

6、率為3.44％，sca-1陽(yáng)性率為53.46％。
　　2）他汀對(duì)缺氧/無(wú)血清干細(xì)胞的作用:高濃度他汀(1μ mol/l，10μ mol/l)組較對(duì)照組鏡下觀察細(xì)胞皺縮明顯，流式細(xì)胞儀初步分析凋亡率較對(duì)照組高（對(duì)照組:20.5％，1μ mol/l:29.5％，10μ mol/l:28.2％，p＜0.05）;低濃度他汀較對(duì)照組凋亡率(對(duì)照組:20.5％，10-3μ mol/l:19.2％，10-2μ mol/l:23.2％)不明顯。<