臍帶干細(xì)胞的分離、鑒定及分化為心肌和內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、心血管疾病嚴(yán)重威脅人類的健康，細(xì)胞移植或體外構(gòu)建組織工程移植物將是一個(gè)很有前景的治療選擇。但組織工程移植物面臨再血管化或內(nèi)皮化的問題，最近研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在體外可以分化為心肌和內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞移植和構(gòu)建組織工程移植物有非常重要的意義。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是研究最多的干細(xì)胞，但是隨著年齡的增加，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量和體外增殖分化能力都明顯減弱，這需要我們?nèi)ふ腋玫母杉?xì)胞來源，臍帶組織是非常有希望的干細(xì)胞替代來源。 第一部分，采用膠原

2、酶消化法從臍帶組織中分離干細(xì)胞，新鮮分離的臍帶細(xì)胞在培養(yǎng)72h后，開始貼壁，5天后貼壁細(xì)胞開始增多，形成細(xì)胞克隆，傳代培養(yǎng)，細(xì)胞逐漸純化，形態(tài)呈均一的細(xì)長梭形。流式細(xì)胞儀分析這些細(xì)胞表達(dá)CD13，CD29，CD44，CD90，CD166和MHC-Ⅰ，而不表達(dá)造血和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，如CD31、CD34、CD38、CD45、CD106、CD117，CD144和MHC-Ⅱ，經(jīng)多次傳代后，表面分子表達(dá)無明顯改變。在成骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)

3、后，VonKossa染色和油紅O染色陽性，說明其能夠分化為骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。這說明分離的臍帶細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似的特性，證明了其干細(xì)胞特性，稱之為UCDS細(xì)胞。 第二部分，研究了在5-氮胞苷的作用下，UCDS細(xì)胞能否分化為心肌樣細(xì)胞。5-氮胞苷誘導(dǎo)后，細(xì)胞的形態(tài)不斷發(fā)生變化，但是沒有觀察到明顯的肌管形成，也沒有觀察到可以跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。RT-PCR檢測顯示分化后的UCDS細(xì)胞表達(dá)心肌特異性基因肌鈣蛋白T，免疫組化檢測誘

4、導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)心肌特異性α-肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和肌鈣蛋白T，表達(dá)率在50％以上。電鏡下觀察，誘導(dǎo)4周后，UCDS細(xì)胞有明顯的肌絲樣結(jié)構(gòu)形成，說明在5-氮胞苷的作用下，UCDS細(xì)胞能夠分化為心肌樣細(xì)胞。 第三部分，研究在內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子的作用下，UCDS細(xì)胞能否向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。在體外經(jīng)過誘導(dǎo)之后，細(xì)胞形態(tài)不斷發(fā)生變化，形成網(wǎng)格樣結(jié)構(gòu)。免疫熒光顯示，分化后的UCDS細(xì)胞CD31、CD34染色陽性，具有攝取