三七總甙對小鼠成體心肌干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化的干預(yù)研究.pdf

1、目的：建立體外分離、培養(yǎng)、純化小鼠成體心肌干細(xì)胞的方法，鑒定心肌干細(xì)胞表面標(biāo)記，探討其生物學(xué)特性，研究三七總甙對小鼠成體心肌干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化的干預(yù)作用，為心肌梗死的心肌干細(xì)胞移植治療尋找切入點(diǎn)。
　　 方法：通過機(jī)械剪切和酶消化法從C57小鼠心臟中分離出單細(xì)胞懸液，置于含DMEM/Ham's F12，10％FBS，2％B27，10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF，10ng/mlCT-1，10ng/ml LIF，100

2、IU/ml青霉素，100μg/ml的自擬培養(yǎng)液中原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)后體外擴(kuò)增，觀察細(xì)胞形態(tài)和生長。應(yīng)用免疫磁珠法分選、純化出sca-1+細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分選純度。體外培養(yǎng)擴(kuò)增sca-1+細(xì)胞，記數(shù)并描繪細(xì)胞生長曲線。應(yīng)用三七總甙(終末濃度為20μg/ml、40μg/ml、80ug/ml、160ug/ml)對sca-1+細(xì)胞進(jìn)行分組誘導(dǎo)分化，5-氮胞苷(終末濃度為10μmol/L)為對照，分別誘導(dǎo)24h、3天、1周、2周，并設(shè)立空

3、白對照組。免疫熒光染色法檢測細(xì)胞表達(dá)心肌特異性抗體肌鈣蛋白T、連接蛋白43的陽性細(xì)胞比率(％)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(±s)％表示，采用單因素方差分析分別比較三七總甙與空白對照及5-氮胞苷誘導(dǎo)組之間的差異。P<0.05為差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：相差顯微鏡下觀察從C57小鼠心臟組織中分離的細(xì)胞，可見散在體積小、圓形、折光性強(qiáng)的細(xì)胞，免疫磁珠法從傳代培養(yǎng)的細(xì)胞中分選、純化

4、出sca-1+細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測分選后細(xì)胞表達(dá)Sca-1陽性在87.4％，CD34陽性表達(dá)率為0.6％。應(yīng)用10μmol/L的5-氮胞苷誘導(dǎo)組可以誘導(dǎo)純化后的心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，但1周后作用減退?？瞻讓φ战M兩周內(nèi)無誘導(dǎo)分化作用。三七總甙組可以誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，且不同濃度誘導(dǎo)分化的效果不同，濃度小于40μg/ml三七總甙無明顯誘導(dǎo)分化作用；80ug/ml三七總甙組在三天、一周、兩周表達(dá)cTnT陽性率分別為(11.4±0

5、.82)％、(19.14±0.79)％、(20.21±0.84)％，表達(dá)connexin-43陽性細(xì)胞表達(dá)率分別為(10.23±1.35)％、(20.45±0.82)％、(21.78±0.92)％，相對5-氮胞苷誘導(dǎo)組的cTnT及connexin-43表達(dá)陽性率明顯增高，誘導(dǎo)24小時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.78)，3天、7天、14天，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中80ug/ml三七總甙組表達(dá)率隨時(shí)間的延長，表達(dá)的陽性率增加，具有統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：從C57小鼠心臟組織可以分離出圓形、折光性強(qiáng)的小細(xì)胞，反復(fù)貼壁法難以達(dá)到富集心肌干細(xì)胞的目的。應(yīng)用免疫磁珠法分選系統(tǒng)能夠分選、純化出高純度的sca-1+細(xì)胞，在自擬的心肌干細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)能夠不斷擴(kuò)增，生長狀態(tài)良好，并保持未分化狀態(tài)。10μmol/L的5-氮胞苷可以誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，誘導(dǎo)速度快，但持續(xù)時(shí)間短，可能是誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞應(yīng)采用小劑量的濃度。三七總甙可以誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞向心