脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化內(nèi)皮細(xì)胞及褪黑素調(diào)控研究.pdf

1、目的:人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)是一種具有很強(qiáng)的體外增殖能力和分化潛能的干細(xì)胞,因存在生物學(xué)特性穩(wěn)定、來源充足、易于體外培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)已引起各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。本研究旨在:①建立hADSCs的原代培養(yǎng)體系,并在無血清培養(yǎng)基中將其轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞；②觀察hADSCs與聚ε-己內(nèi)酯共聚物可降解材料的相容性,增長(zhǎng)速率以及轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的程度,為hA

2、DSCs成血管的臨床應(yīng)用提供體外的研究依據(jù)；③觀察褪黑素對(duì)hADSCs轉(zhuǎn)分化內(nèi)皮細(xì)胞和血管形成過程中,內(nèi)皮細(xì)胞表型vWF、VE-cadherin表達(dá),細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度以及ERK、p-ERK表達(dá)的變化,探索褪黑素對(duì)hADSCs轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)、血管形成及保護(hù)機(jī)制。
　　 方法:從健康人體抽脂術(shù)獲得的脂肪,利用本實(shí)驗(yàn)室建立的培養(yǎng)方法,進(jìn)行hADSCs的原代培養(yǎng),并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫表型和成骨和脂肪細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其干細(xì)胞

3、的分化能力；用含40ng/ml的VEGF和10ng/ml的bFGF的無血清分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)hADSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)vWF和VE-Cadherin兩種內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)抗原,透射電鏡檢測(cè)WP小體、成血管實(shí)驗(yàn)和Dil-Ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)是否分化為內(nèi)皮細(xì)胞。將hADSCs種植在孔徑分別為60—80μm和180—200μm的聚ε-己內(nèi)酯共聚物材料上,計(jì)算接種率。用掃描電鏡及免疫熒光標(biāo)記發(fā)觀察細(xì)胞在材料上的分布及相容性,C

4、CK-8法繪制增殖曲線。在材料進(jìn)行hADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn),分化50天后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表型vWF和VE-Cadherin,及免疫熒光法檢測(cè)Flk-1。選擇不同濃度(10、1.0和0.1μmol/L)的MT作用于第三代hADSCs處理8 d后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)vWF和VE-Cadherin變化。用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)Fluo-13標(biāo)記的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)變化。將不同濃度MT處理24 h的hADSC種

5、植至Matrigel膠上,觀察細(xì)胞成血管能力。利用Western blot技術(shù)分析MT處理8 d后hADSCs的ERK和p-ERK表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:①hADSCs經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析,CD45(-)CD14(-)CD44(+)CD29(+)CD105(+)表明該細(xì)胞為人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,并且可分化成骨成脂細(xì)胞。隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng),vWF和VE-Cadherin的表達(dá)不斷增加,并且可在電鏡下觀察到WP小體的出現(xiàn)以及在光鏡下

6、觀察到分化30天的hADSCs具有成血管的能力和攝取Dil-Ac-LDL的能力。②種植到材料上后,掃描電鏡下觀察細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形依附于多孔材料表面。60—80μm孔徑的材料細(xì)胞接種率為(98.33±0.33)％,明顯大于180-200μm孔徑材料上的細(xì)胞接種率(90.33±1.45)％；增殖曲線亦是如此。選擇60-80μm孔徑的材料進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),分化50天后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)vWF和VE-cadherin的陽(yáng)性率分別為(80.9±

7、0.90)％和(84.3±1.10)％,免疫熒光化學(xué)檢測(cè)Flk-1顯示大多數(shù)細(xì)胞表面均表達(dá)Flk-1。③10μmol/LMT處理的hADSCs的vWF(13.15±4.55)％和VE—Cadherin(17.96±8.74)％較空白對(duì)照組的vWF和VE-Cadehrin無顯著性差異(P>0.05)；而1μmol/L MT處理的hADSCs的vWF(19.99±1.74)％和VE—Cadherin(21.13±9.74)％,以及0.1μm

8、ol/L MT處理的hADSCs的vWF(43.66±0.89)％和VE-Cadherin(49.42±4.92)％,均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。40μmol/L預(yù)處理24小時(shí)后再給予MT的hADSCs的vWF和VE-cadherin陽(yáng)性率均明顯低于MT直接加藥組。10、1.0和0.1μmol/L MT處理8天后的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)[Ca2+]i較非MT分化8天組分別升高-46.02％、12.27％和99.09％。在倒置相差顯微鏡下發(fā)

9、現(xiàn),1.0和0.1μmol/L MT處理24 h后,hADSC形成血管管腔結(jié)構(gòu)；空白對(duì)照組和10μmol/LMT組hADSCs無血管管形結(jié)構(gòu)形成,40μmol/L預(yù)處理24小時(shí)后再給予MT的hADSCs也無法形成血管管形結(jié)構(gòu)。與空白對(duì)照組相比,0.1μmol/L MT處理組hADSC p-ERK水平明顯增高(P<0.05),10μmol/L組p-ERK降低顯著(P<0.05),而三個(gè)不同濃度藥物組ERK水平和空白組相比無顯著性差異(P>

10、0.05)
　　 結(jié)論:①本實(shí)驗(yàn)成功從人體脂肪中分離得到間充質(zhì)干細(xì)胞,并且在無血清條件下可將其分化為內(nèi)皮細(xì)胞。②將hADSCs種植在孔徑分別為60-80μm和180-200μm的聚ε-己內(nèi)酯共聚物材料上,孔徑大小為60-80μm聚ε-己內(nèi)酯共聚物材料較適合于hADSCs的生長(zhǎng)和增殖,并可在材料上有效分化為內(nèi)皮細(xì)胞。③1和0.1μmol/LMT可以明顯促進(jìn)hADSCs向EC分化,其機(jī)制為通過促進(jìn)[Ca2+]i的增加,激活細(xì)胞分化過