新生小鼠心肌干細(xì)胞培養(yǎng)與分化的研究.pdf

1、背景： 成體心臟內(nèi)存在具有特異性心肌分化潛能的多能干細(xì)胞，成體心肌干細(xì)胞(Cardiac stem cells CSC)是存在于發(fā)育成熟機(jī)體心臟組織中的具有高度自我更新和特異性心肌分化、增殖潛能的未分化細(xì)胞。它具有以下幾點(diǎn)主要的細(xì)胞生物學(xué)特性：①具有克隆能力、能夠自我更新和有多能性；②能迅速發(fā)育成結(jié)構(gòu)和功能成熟的心肌細(xì)胞和血管系統(tǒng)；③只需在損傷局部激活、遷移，不需采集和擴(kuò)增。 目的： 研究新生小鼠心肌干細(xì)胞原代和

2、傳代的培養(yǎng)及其分化潛能，為缺血及壞死心肌重建的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 內(nèi)容： 1．在過(guò)去研究方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行改良，成功建立一種更加穩(wěn)定、高效的體外成體心肌干細(xì)胞分離、純化的方法。 2．誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞分化為搏動(dòng)的心肌細(xì)胞。 3．通過(guò)免疫熒光技術(shù)、流式細(xì)胞儀、RT-PCR等鑒定方法，基本明確細(xì)胞表型，并將原有的方法與改良后的方法進(jìn)行比較。 方法： 1．原有的方法是組織塊貼壁法，僅僅使用眼科剪

3、刀將心肌組織剪碎，用培養(yǎng)液潤(rùn)洗后，必須要等待組織塊貼壁之后才能添加培養(yǎng)液，組織塊很容易漂浮起來(lái)。經(jīng)過(guò)不斷的觀察和實(shí)驗(yàn)，將原有方法進(jìn)行改良，采用微小組織塊懸浮貼壁法，在用剪刀將心肌組織剪碎的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)胰酶消化，棄去消化液，使用膠頭滴管反復(fù)吹打組織塊后離心，加入CEM培養(yǎng)液重懸后進(jìn)行培養(yǎng)。 2．待其長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后進(jìn)行傳代，傳代細(xì)胞用CGM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，約1-2周可見(jiàn)單個(gè)搏動(dòng)的傳代細(xì)胞，也可見(jiàn)成團(tuán)細(xì)胞的同步收縮。 3．免疫熒

4、光染色法標(biāo)記原代與傳代細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞表面是否帶有c-kit、Sca-1、MHCⅡ熒光。 4．流式細(xì)胞儀鑒定原代與傳代細(xì)胞表面標(biāo)記c-kit、Sca-1、MHC Ⅱ、CD34、CD8。 5．半定量RT-PCR檢測(cè)原代與傳代細(xì)胞心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA-4的表達(dá)。 結(jié)果： 1．采用改良后的方法從消化后的心肌組織塊中成功培養(yǎng)得到原代細(xì)胞，進(jìn)行免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀鑒定其表型為c-kit、Sca-1

5、陽(yáng)性的細(xì)胞，表面不表達(dá)CD34、CD8、MHCⅡ。 2．細(xì)胞經(jīng)傳代后培養(yǎng)l周左右，開(kāi)始出現(xiàn)搏動(dòng)，也可見(jiàn)成團(tuán)細(xì)胞的同步收縮。再次經(jīng)免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀鑒定其表型為c-kit、sca-1陰性，MHCⅡ陽(yáng)性，仍然不表達(dá)CD34、CD8。 3．半定量RT-PCR檢測(cè)原代細(xì)胞不表達(dá)心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA-4，而傳代培養(yǎng)1周后的細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)GATA-4。 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞共經(jīng)過(guò)8次流式細(xì)胞儀

6、檢測(cè)表面標(biāo)記物陽(yáng)性的細(xì)胞所占的百分比后，所得到的數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用配對(duì)樣本的，檢驗(yàn)方法來(lái)比較表面標(biāo)記物陽(yáng)性的原代與傳代細(xì)胞所占百分比的差異，P 值代表兩者之間的差異性，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中c-kit、Sca-1、MHC Ⅱ三種抗體陽(yáng)性的細(xì)胞所占百分比的 P 值小于0.05，差異有顯著性；而CD34、CD8兩種抗體陽(yáng)性的細(xì)胞所占百分比的 P 值大于0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5．另外，采

7、用兩樣本的 t 檢驗(yàn)方法比較同一批培養(yǎng)的原代和傳代細(xì)胞，分別使用原方法與改良后的方法進(jìn)行培養(yǎng)，所得到的細(xì)胞表面標(biāo)記物陽(yáng)性所占百分比的差異，P值代表兩者之間的差異性，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)過(guò)分析后發(fā)現(xiàn)無(wú)論是原代細(xì)胞還是傳代細(xì)胞，分別使用兩種方法的c-kit、Sca-1、MHC Ⅱ三種抗體標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比的 P 值均小于0.05，兩者的差異有顯著性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1．在原有方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)其進(jìn)