外周血基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及其向施萬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化.pdf

1、近年來,干細(xì)胞移植已經(jīng)被認(rèn)為足修復(fù)神經(jīng)損傷最具應(yīng)用前景的治療策略之一。該領(lǐng)域被廣泛研究和關(guān)注的干細(xì)胞主要有胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和臍帶血基質(zhì)干細(xì)胞等。除了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞外,目前其它類型干細(xì)胞大多需要從異體獲取,它們在運(yùn)用過程存在較嚴(yán)重的道德倫理和免疫排斥等問題。而骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在取材過程對患者本身帶來較大的痛苦。所以,有必要研究及尋求更好的干細(xì)胞來源。
　　 大量研究已經(jīng)證實臍帶血干細(xì)胞與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的表型非常

2、相似,也都具有高度的增殖和分化潛能。從發(fā)育生物學(xué)來看,臍帶血實質(zhì)上就是胎兒血。這也就說明,直到出生時人體血液中還存在大量的具有高度增殖和分化潛能的干細(xì)胞。鑒于此,本研究擬探討成體外周血中是否還存在這些干細(xì)胞,并建立分離培養(yǎng)外周血基質(zhì)干細(xì)胞(Peripheral blood derived mesenchymal stemcells,PBMSCs)的方法。
　　 由于施萬細(xì)胞具有分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子,引導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)再生的功能,它常

3、常被應(yīng)用于修復(fù)中樞和周圍神經(jīng)損傷。但是傳統(tǒng)從外周神經(jīng)分離培養(yǎng)施萬細(xì)胞的方法明顯限制了施萬細(xì)胞的來源,近年來許多研究者均采取定向誘導(dǎo)的方法從干細(xì)胞分化獲得施萬細(xì)胞。所以,本研究在獲得外周血基質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上,探討將其在體內(nèi)外誘導(dǎo)成定向誘導(dǎo)為施萬細(xì)胞的方法,為進(jìn)一步將其用于修復(fù)神經(jīng)損傷打下基礎(chǔ)。
　　 本研究分為三個部分。
　　 第一部分:PBMSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 從SD大鼠取血分離培養(yǎng)PBMSCs,采用

4、流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)法對其細(xì)胞表面抗原進(jìn)行檢測與鑒定,流式細(xì)胞術(shù)顯示培養(yǎng)獲得的PBMSCs中CD29、CD90、CD45、CD11b、CD106及CD49d的陽性率分別為99.96％、71.22％、46.62％、19.97％、10.76％和5.46％。免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示PBMSCs呈CD44和CD106陽性,CD34陰性。并用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測BrdU作用4h后BrdU的陽性率。第2代PBMSCs BrdU陽性率為(34.1±4.3

5、)％。以上結(jié)果顯示外周血分離獲得的干細(xì)胞具有基質(zhì)干細(xì)胞的特性。
　　 第二部分:PBMSCs在體外誘導(dǎo)分化成為施萬細(xì)胞
　　 PBMSCs經(jīng)β-巰基乙醇、傘反式維甲酸及復(fù)合條件培養(yǎng)基(1％N2、50ng/mlheregulin、5 μ M forskolin、10ng/ml bFGF及5ng/ml PDGF)等三個步驟向施萬細(xì)胞定向誘導(dǎo)后,用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測S-100和P75的表達(dá)。結(jié)果顯示S-100和P75的陽性率分

6、別是(75.2±4.1)％和(78.9±4.6)％。表明PBMSCs在特定的條件下可定向分化成為施萬細(xì)胞。
　　 第三部分:PBMSCs在損傷坐骨神經(jīng)內(nèi)分化成為施萬細(xì)胞
　　 制作大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型后向損傷處移植GFP陽性PBMSCs。術(shù)后1w、2w、6w時取材、切片并進(jìn)行進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),移植的PBMSCs在坐骨神經(jīng)內(nèi)能分化成為施萬細(xì)胞樣細(xì)胞,大量GFP陽性移植細(xì)胞表達(dá)施萬細(xì)胞的標(biāo)志蛋白S-100和P75。另