神經(jīng)母細胞瘤腫瘤干細胞的培養(yǎng)、鑒定及誘導分化研究.pdf

1、目的：腫瘤干細胞假說認為腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）與腫瘤的發(fā)生、轉移、復發(fā)、耐藥密切相關，該假說提出以后，腫瘤干細胞的分離和純化成為研究的關鍵。研究發(fā)現(xiàn)，通過體外特定的無血清條件下培養(yǎng)原代腫瘤細胞，能形成富集腫瘤干細胞的腫瘤球，從而達到初步分離和純化腫瘤干細胞的目的。本研究旨在建立體外懸浮培養(yǎng)神經(jīng)母細胞瘤腫瘤球的方法，并證實腫瘤球中富含腫瘤干細胞。高危神經(jīng)母細胞瘤（neuroblastoma，NB）病人經(jīng)誘導

2、化療和清髓性鞏固治療后大部分會復發(fā)，很可能與存在含有腫瘤干細胞的微小殘留病灶有關。本實驗通過體外觀察并鑒定13-順維甲酸能誘導神經(jīng)母細胞瘤干細胞分化，為臨床用13-順維甲酸治療神經(jīng)母細胞瘤提供實驗依據(jù)。
　　 方法：在特定的無血清干細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)神經(jīng)母細胞瘤原代腫瘤細胞，建立體外懸浮培養(yǎng)神經(jīng)母細胞瘤腫瘤球的方法；將細胞懸液濾過篩網(wǎng)，分離得到神經(jīng)母細胞瘤腫瘤球；用RT-PCR法比較成球細胞和原代腫瘤細胞中干細胞基因Oct-4和

3、Bmi-1的表達差異；通過單克隆形成實驗檢測成球細胞的單克隆形成能力和腫瘤球形成能力；用裸鼠體內(nèi)成瘤實驗驗證腫瘤球細胞的體內(nèi)成瘤能力；在添加5uM 13-順維甲酸分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)母細胞瘤腫瘤球細胞，觀察誘導分化過程中成球細胞的形態(tài)演變，RT-PCR檢測誘導過程中干細胞標記 Oct-4 表達的變化，細胞免疫熒光檢測誘導分化前后神經(jīng)干細胞標記 nestin 的表達差異。
　　 結果：神經(jīng)母細胞瘤細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天后

4、形成懸浮腫瘤球； RT-PCR結果證實腫瘤球細胞較原代神經(jīng)母細胞瘤細胞高表達干細胞基因 Oct-4 和 Bmi-1；部分來自腫瘤球的單個細胞能再次分裂增殖為單克隆腫瘤球，克隆形成率和單克隆腫瘤球形成率分別為55.3％和26.3％；1×104個腫瘤球細胞14d后形成裸鼠腋下移植瘤，而且成球細胞能高效連續(xù)成瘤；13-順維甲酸誘導分化過程中，成球細胞的形態(tài)逐漸趨向神經(jīng)元，RT-PCR檢測誘導后的成球細胞干細胞標記 Oct-4 的表達降低，細胞