神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞鑒定與微小殘留病檢測(cè)研究.pdf

1、目的: 闡明神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)骨髓微量腫瘤病灶（minimal residual disease, MRD）檢測(cè)方法及結(jié)果對(duì)預(yù)后的影響；建立NB骨髓轉(zhuǎn)移細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定實(shí)驗(yàn)方法。 方法: 1、應(yīng)用CD45-FITC/CD81-PE/CD56-PECy5單抗組合通過流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測(cè)了人NB細(xì)胞株TGW的免疫表型并確定本實(shí)驗(yàn)室FCM的敏感度為1

2、×10-4；比較Ⅲ～Ⅳ期NB患兒治療前及治療中骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查與FCM檢測(cè)BM中的CD45-/ CD81+/ CD56+細(xì)胞陽(yáng)性率；通過對(duì)NB患兒治療前及治療不同階段的BM MRD檢測(cè)分析其應(yīng)用價(jià)值。 2、應(yīng)用熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)法（fluorescent quantitation-polymerase chain reaction,FQ-PCR）檢測(cè)骨髓微量神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxyla

3、se, TH)表達(dá)，建立了以TH為靶基因FQ-PCR方法檢測(cè)微量神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的方法。共檢測(cè)臨床NB標(biāo)本26例，其中包括24例骨髓標(biāo)本，1例胸水標(biāo)本和1例干細(xì)胞采集物，陰性對(duì)照為5例正常兒童和11例非神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒骨髓。 3、我院血液科門診及病房伴骨髓轉(zhuǎn)移的NB患兒共17例,經(jīng)骨髓穿刺發(fā)現(xiàn)NB細(xì)胞及病理確診，患兒骨髓中瘤細(xì)胞鏡檢比例50-80％。無菌條件下取NB骨髓轉(zhuǎn)移患者骨髓，用Ficoll分離單個(gè)核細(xì)胞，加入含有雙抗（青

4、霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml）的20％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液中，接種于6孔培養(yǎng)板中5％C02, 37℃培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，同時(shí)分別應(yīng)用FCM檢測(cè)CD45-/ CD81+/ CD56+的表達(dá)、FQ-PCR方法檢測(cè)TH的表達(dá)及免疫組化方法對(duì)原代培養(yǎng)的NB骨髓轉(zhuǎn)移細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 結(jié)果: 1、比較了35例初診時(shí)FCM檢測(cè)BM MRD陽(yáng)性患兒平均化療4個(gè)療程后MRD結(jié)果與預(yù)后

5、關(guān)系，化療4個(gè)療程后15例患兒MRD轉(zhuǎn)陰，其中5例復(fù)發(fā)，其余10例隨訪至今無復(fù)發(fā)及進(jìn)展，無瘤生存平均時(shí)間23.77個(gè)月；另外20例患兒化療4個(gè)療程后MRD仍為陽(yáng)性，其中10例患兒復(fù)發(fā)或進(jìn)展，包括1例死亡，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較了化療后移植患兒外周血干細(xì)胞（peripheral blood stem cell, PBSC）采集前骨髓MRD結(jié)果與預(yù)后的相關(guān)性：共有24例患兒接受化療后行外周血干細(xì)胞移植，18例患兒采集PBSC時(shí)骨髓MRD

6、為陰性，其中5例患兒復(fù)發(fā)，自移植后始DFS平均時(shí)間32.45個(gè)月；6例患兒采集PBSC時(shí)骨髓MRD為陽(yáng)性，5例復(fù)發(fā)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、通過倍比稀釋NB細(xì)胞于正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞中，本文確定了FQ-PCR法的敏感性為1×10-5，即可檢測(cè)到105個(gè)正常骨髓細(xì)胞中的一個(gè)腫瘤細(xì)胞。26例NB標(biāo)本中陽(yáng)性24例，陰性2例。陽(yáng)性對(duì)照TGW細(xì)胞株表達(dá)TH；陰性對(duì)照組非腫瘤患兒和其他實(shí)體瘤患兒骨髓標(biāo)本均不表達(dá)TH。相同的標(biāo)本同時(shí)行骨髓細(xì)

7、胞學(xué)檢查及FCM檢測(cè)，F(xiàn)Q-PCR陽(yáng)性率為92.3％，F(xiàn)Q-PCR結(jié)果陽(yáng)性者細(xì)胞學(xué)檢查和FCM（76.9％）結(jié)果均為陽(yáng)性。 3、我們對(duì)17例骨髓轉(zhuǎn)移的NB患者進(jìn)行NB骨髓轉(zhuǎn)移細(xì)胞體外原代培養(yǎng),傳代超過15代有5例，其中2例超過20代，經(jīng)FCM、FQ-PCR方法、免疫組化鑒定為NB細(xì)胞，最終細(xì)胞因反復(fù)傳代失去強(qiáng)增殖能力。 結(jié)論: 1、運(yùn)用FCM檢測(cè)NB患兒BM中的MRD敏感度高、特異性強(qiáng)，可協(xié)助初診NB患兒的診斷、