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文檔簡介
1、狂犬?。╮abies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)而引起的一種烈性人獸共患傳染病。感染狂犬病病毒并出現(xiàn)臨床癥狀的人或動物幾乎百分之百死亡。預(yù)防和治療狂犬病成為近幾十年的重要課題之一,目前狂犬病以預(yù)防為主,而在治療方面成效寥寥。病毒是一種專性細胞寄生生物,其依賴生物體復(fù)制和傳播,因此,探討狂犬病病毒與細胞的生物互作尤為重要。
自噬,作為一種細胞自我保護性機制,進化上高度保守,廣泛存在于真核
2、生物,其主要功能是將細胞內(nèi)生物大分子及損壞的細胞器在溶酶體內(nèi)消化分解后供生物體重新利用,與凋亡、壞死一起稱為三大細胞死亡機制。自噬按其功能分為大自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。
自噬和病毒關(guān)系的研究近些年報道較多,有些病毒具備了逃逸宿主細胞自噬的功能,有些病毒在長期的進化中學(xué)會了如何利用細胞自噬來促進自身轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。彈狀病毒科的其他成員:水皰性口炎病毒(VSV),出血性敗血癥病毒(VHSV)和鯉春病毒血癥病毒(SVCV)能夠
3、誘導(dǎo)細胞自噬,但對于狂犬病病毒與細胞自噬關(guān)系的研究目前尚未報道,本研究從以下幾個方面對狂犬病毒與細胞自噬的關(guān)系進行探討。
一、狂犬病病毒的感染誘導(dǎo)SK和NA細胞發(fā)生自噬。為了明確狂犬病病毒是否能夠誘導(dǎo)細胞自噬,我們選擇生物學(xué)特性截然不同的兩株狂犬病病毒:強毒株GD-SH-01和弱毒株HEP-Flury病毒,通過對兩株病毒感染SK和NA細胞后的western-blot檢測,電鏡觀察以及轉(zhuǎn)染GFP-LC3B質(zhì)粒后觀察GFP熒光點分
4、布的方法,我們最終確定狂犬病病毒強毒株GD-SH-01株病毒可以誘導(dǎo)明顯的細胞自噬,而弱毒株的自噬水平與未感染狂犬病病毒的空白細胞組相似。以上實驗結(jié)果證明細胞自噬的誘導(dǎo)是病毒株特異的。自噬誘導(dǎo)差異是否與強弱毒株特性相關(guān)還有待探討。
二、狂犬病病毒誘導(dǎo)的細胞自噬與凋亡的關(guān)系。細胞自噬作為一把雙刃劍,既是一種細胞保護性機制又可以誘導(dǎo)細胞走向死亡。細胞自噬和細胞凋亡同為細胞程序性死亡,其相關(guān)研究已有很多報道,主要概括為合作關(guān)系、對抗
5、關(guān)系及推動關(guān)系。我們的實驗結(jié)果證明狂犬病病毒強毒株GD-SH-01可以同時誘導(dǎo)細胞自噬和凋亡,接著我們探討了狂犬病病毒誘導(dǎo)的細胞自噬和凋亡的關(guān)系。我們通過增強其中一種現(xiàn)象來看另一種發(fā)生的變化的方法來進行研究,結(jié)果顯示在加入自噬增強劑的細胞組狂犬病病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡現(xiàn)象明顯弱于未加藥物組,這個現(xiàn)象說明GD-SH-01誘導(dǎo)的細胞自噬是作為一種細胞保護性機制來消除病毒誘導(dǎo)的細胞凋亡這種不利細胞存活的生物學(xué)過程。
三、GD-SH-01
6、的M基因?qū)ψ允傻挠绊???袢〔《镜幕蚪M由5個結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成:N,P,M,G,L,那么究竟是哪個基因在狂犬病病毒誘導(dǎo)細胞自噬方面起到最關(guān)鍵的作用呢,我們實驗室通過將GD-SH-01的單個結(jié)構(gòu)蛋白基因與相對應(yīng)HEP-Flury基因進行替換和病毒拯救,得到5株重組狂犬病病毒:rHEP-shN、rHEP-shP、rHEP-shM、rHEP-shG和rHEP-shL,通過對其感染細胞后細胞自噬水平的研究得出rHEP-shM與GD-SH-01一樣可
7、以誘導(dǎo)明顯的LC3-I/LC3-II轉(zhuǎn)換,而rHEP-shN、rHEP-shP、和rHEP-shG只能誘導(dǎo)較弱的細胞自噬。從而初步得出GD-SH-01的M基因在誘導(dǎo)細胞自噬方面起到最主要的作用。接下來,我們構(gòu)建了4個質(zhì)粒,它們分別可以表達結(jié)構(gòu)蛋白與mRFP蛋白融合的融合蛋白。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后我們發(fā)現(xiàn)單個蛋白在細胞中的表達并不能誘導(dǎo)細胞自噬,因此GD-SH-01誘導(dǎo)的細胞自噬是與病毒粒子的特性有關(guān)而不是單個狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以誘導(dǎo)的。
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