藍(lán)舌病病毒感染誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用和機(jī)制.pdf

1、藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的一種重要蟲(chóng)媒傳染病，可引起反芻動(dòng)物特別是綿羊較高的發(fā)病率和致死率，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展和畜產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)貿(mào)易造成潛在的巨大威脅。BTV屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬，是一種復(fù)雜的雙鏈分節(jié)段RNA病毒，擁有雙層衣殼，無(wú)囊膜。作為環(huán)狀病毒屬的一個(gè)典型代表，BTV在分子結(jié)構(gòu)、生化特征、流行病學(xué)和診斷方法等分子生物學(xué)領(lǐng)域已取得了重大進(jìn)展，然而，BTV感染與宿主

2、細(xì)胞應(yīng)答之間的相互作用并沒(méi)有得到充分的關(guān)注，因此從宿主的角度去探索BTV的致病機(jī)制顯得尤為重要。
　　病毒作為一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生物，其在感染過(guò)程中必定會(huì)與宿主的胞內(nèi)應(yīng)答發(fā)生相互作用。細(xì)胞自噬(Autophagy)作為一種保守的胞內(nèi)適應(yīng)性應(yīng)答，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)新陳代謝方面起著舉足輕重的作用。它可將細(xì)胞內(nèi)的衰老細(xì)胞器、外源微生物等成分包裹在一個(gè)稱(chēng)為自噬體的雙層膜結(jié)構(gòu)中，運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行降解回收。自噬是對(duì)抗病原體的天然防御機(jī)制，但最

3、近越來(lái)越多的證據(jù)表明許多病毒已進(jìn)化出多種策略抵抗、逃逸、甚至利用細(xì)胞自噬促進(jìn)自身增殖，如流感病毒、丙型肝炎病毒、登革熱病毒、輪狀病毒等。對(duì)于BTV而言，其復(fù)制感染與細(xì)胞自噬之間的相互作用及其啟動(dòng)機(jī)制便是本研究中要探索的問(wèn)題。
　　首先，采用三種經(jīng)典方法對(duì)BTV1感染BSR細(xì)胞后是否誘導(dǎo)自噬進(jìn)行了檢測(cè)，包括透射電鏡觀察自噬體的形成、激光共聚焦檢測(cè)熒光聚點(diǎn)的變化以及Western blot分析LC3的轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，與陰性對(duì)照相比，B

4、TV1感染后誘導(dǎo) BSR細(xì)胞產(chǎn)生了自噬體樣的雙層膜結(jié)構(gòu)，GFP-LC3熒光聚點(diǎn)顯著累積，而且LC3發(fā)生了明顯的類(lèi)別轉(zhuǎn)化。此外，在BTV的自然宿主靶細(xì)胞-原代羊舌上皮細(xì)胞上進(jìn)行了分析，得到了類(lèi)似的結(jié)果。由此證實(shí)BTV1感染可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。
　　其次，進(jìn)行了基于自噬性降解的自噬潮分析。自噬潮，即自噬的整個(gè)動(dòng)態(tài)連續(xù)的過(guò)程，可通過(guò)p62的降解、LC3-II的周轉(zhuǎn)、自噬體和溶酶體共定位分析等綜合評(píng)估。研究結(jié)果顯示，BTV1感染明顯促

5、進(jìn)了自噬底物p62/SQSTM1的降解，而且溶酶體抑制劑CQ的配合使用導(dǎo)致了LC3-II和p62的蓄積，BTV1感染后自噬體標(biāo)記GFP-LC3和溶酶體標(biāo)記LysoTracker也出現(xiàn)明顯的共定位，表明BTV1誘導(dǎo)了自噬的起始和自噬性降解過(guò)程，即BTV1感染后觸發(fā)了完整的自噬潮反應(yīng)。
　　再次，判定BTV1誘導(dǎo)自噬是否嚴(yán)格依賴(lài)于病毒的有效復(fù)制。滅活病毒UV-BTV1不能誘導(dǎo)相同的自噬現(xiàn)象證實(shí)了該推論。進(jìn)一步應(yīng)用自噬早期阻斷藥物3-M

6、A和晚期阻斷藥物CQ處理細(xì)胞或者干擾自噬關(guān)鍵基因Beclin1，可見(jiàn)自噬活性明顯降低，病毒復(fù)制也受到了顯著的抑制；相反，自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin處理細(xì)胞后激活了自噬反應(yīng)，促進(jìn)了BTV1的復(fù)制。上述結(jié)果證明了BTV1的有效復(fù)制是誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵因素，并可以利用自噬促進(jìn)自身增殖。
　　最后，為了深入探索BTV1感染激活自噬的機(jī)制，對(duì)可能涉及的多條信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示，BTV1感染后明顯抑制了自噬的中央調(diào)控分子mTOR

7、的磷酸化及其下游底物p70S6K的活性，從而啟動(dòng)了自噬。而后探索mTOR上游可能的調(diào)控信號(hào)，首先檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BTV1感染激發(fā)細(xì)胞自噬不依賴(lài)于ERK1/2信號(hào)通路。而藥物處理和突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染顯示mTOR活性降低部分取決于PI3K/Akt的失活，相反，激活A(yù)kt后p-mTOR有所恢復(fù)，自噬也相應(yīng)被抑制，說(shuō)明Akt信號(hào)通路參與了BTV1誘導(dǎo)的自噬的啟動(dòng)過(guò)程。最為明顯的是AMPK途徑的影響，通過(guò)藥物處理和RNA干擾實(shí)驗(yàn)等聯(lián)合使用，證實(shí)病毒感染顯著提高

8、了胞漿內(nèi)Ca2+的濃度，并介導(dǎo)了CaMKKβ的激活，作用于下游的AMPK，從而導(dǎo)致mTOR的抑制和自噬的激活。試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)TSC2是Akt/AMPK及mTOR之間信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵中介分子。結(jié)果表明BTV1可通過(guò)抑制Akt和活化Ca2+介導(dǎo)的AMPK來(lái)共同作用于下游的TSC2-mTOR途徑，從而誘導(dǎo)自噬的激活，促進(jìn)病毒自身的復(fù)制。
　　綜上所述，本研究首次闡明了BTV1感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬在BTV1的復(fù)制中發(fā)揮著重要作用，而且系統(tǒng)分析