細(xì)胞自噬在巨細(xì)胞病毒感染復(fù)制中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)屬β皰疹病毒亞科，其中感染人類的是人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)，在人群中普遍感染。人群感染HCMV后通常呈潛伏感染，對健康人體并沒有明顯短期危害，但對免疫功能低下的個體，如艾滋病患者、器官移植患者、干細(xì)胞治療患者、腫瘤患者及使用免疫抑制劑的患者可造成致死性損傷[1]。對嬰幼兒而言，HCMV是最常見的先天性感染病毒，是引起人類

2、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的主要病原之一，可導(dǎo)致胎兒畸形及遲發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等[2-4]。此外HCMV長期反復(fù)激活感染也引發(fā)一些慢性疾病，如動脈粥樣硬化等[5,6]。
　　現(xiàn)代病毒學(xué)認(rèn)為程序性細(xì)胞死亡即是病毒感染導(dǎo)致機(jī)體損傷機(jī)制又是宿主本身一種抗病毒機(jī)制，宿主可通過程序性細(xì)胞死亡可以清除病毒感染的細(xì)胞，抑制病毒復(fù)制。很多針對病毒感染的治療，包括化療以及免疫治療均通過誘導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞死亡而實(shí)現(xiàn)。程序性細(xì)胞死亡主要分為兩種，Ⅰ型為細(xì)胞凋亡

3、(apopto sis)，Ⅱ型是自噬性細(xì)胞死亡(autophagy)。過去關(guān)于細(xì)胞凋亡機(jī)制和信號傳遞的研究幫助我們對病毒感染致病的生物學(xué)特性有了一定的了解，并且在治療新策略方面為我們提供了一些潛在的分子靶點(diǎn)。相反，其它形式的程序性細(xì)胞死亡在病毒致病性中的作用卻研究較少。
　　研究目的:
　　在此項(xiàng)研究中，我們將著力于掌握細(xì)胞自噬及其mTOR信號通路在HCMV感染過程中的作用。本項(xiàng)目研究的具體目的如下:
　　1.掌握HC

4、MV感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬及其mTOR信號通路表達(dá)變化;
　　2.掌握細(xì)胞自噬及其mTOR信號通路在HCMV感染復(fù)制過程中的作用及其機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.檢測HCMV感染不同時(shí)期誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬狀態(tài)以及mTOR信號通路關(guān)鍵分子及其下游蛋白的表達(dá)水平
　　將HCMV以MOI為1接種HELF細(xì)胞（人胚肺成纖維細(xì)胞），設(shè)立滅活病毒對照組，作用1h、2h、4h、8h、24h、2d、4d、8d后分別作如下檢測:

5、r>　　1.1.自噬通過以下方法檢測:電子顯微鏡檢測自噬性細(xì)胞死亡形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、吖啶橙細(xì)胞染色熒光顯微鏡檢測細(xì)胞自噬、流式細(xì)胞儀定量檢測吖啶橙熒光顆粒陽性細(xì)胞數(shù)、構(gòu)建自噬標(biāo)記物pGFP-LC3轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞，經(jīng)不同組HCMV感染后激光共聚焦顯微鏡檢測自噬激活、Western檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3表達(dá)。
　　1.2.mTOR信號通路關(guān)鍵分子表達(dá)水平檢測:Western Blot檢測各組細(xì)胞mTOR信號通路關(guān)鍵分子p-p70S6K(磷酸

6、化的p70S6K)、p-4E-BP1（磷酸化的4E-BP1）表達(dá)水平。
　　2.通過對使用自噬抑制劑、促進(jìn)劑作用后不同時(shí)間點(diǎn)的病毒感染、復(fù)制、釋放動力學(xué)檢測，判斷宿主細(xì)胞自噬狀態(tài)對病毒增殖復(fù)制過程中的影響。
　　事先分別用自噬抑制劑3-MA及自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素用于HELF細(xì)胞，然后將HCMV以MOI為1分別接種HELF細(xì)胞（人胚肺成纖維細(xì)胞），設(shè)立滅活病毒對照組，作用12h、24h、36h、48h、60h。
　　2.1

7、.病毒增殖動力學(xué)檢測:收集細(xì)胞培養(yǎng)物和上清，凍融三次后，空斑實(shí)驗(yàn)檢測病毒滴度。
　　2.2.病毒特異性蛋白表達(dá)檢測:采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測不同時(shí)間點(diǎn)病毒特異性蛋白表達(dá)變化。
　　2.3.病毒基因拷貝數(shù)檢測:熒光定量PCR檢測。
　　3.建立巨細(xì)胞病毒感染動物模型技術(shù)，在體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證巨細(xì)胞病毒感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞自噬狀態(tài)改變。
　　BALB/c小鼠經(jīng)腹腔接種小鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)，建立小鼠巨細(xì)胞病毒感染小鼠模型，通過病

8、毒分離、免疫熒光和PCR技術(shù)檢測模型小鼠感染狀態(tài)，通過Western Blot檢測細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表達(dá)水平和透射電鏡檢測檢測模型小鼠肺組織細(xì)胞自噬。
　　研究結(jié)果:
　　1.吖啶橙染色、轉(zhuǎn)染GFP-LC3熒光顯微鏡觀察和透射電鏡觀察結(jié)果表明HCMV感染12h可明顯促進(jìn)HELF細(xì)胞自噬，HCMV感染36h后轉(zhuǎn)變?yōu)橐种艸ELF細(xì)胞自噬。免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)HCMV感染12h抑制mTOR自噬信號通路下游關(guān)鍵分子表

9、達(dá)，感染36h后轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)mTOR信號通路下游關(guān)鍵分子表達(dá)。
　　2.自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素組HCMV AD169株病毒DNA拷貝數(shù)、HCMV pp65蛋白表達(dá)量及病毒滴度均較正常對照組高，而自噬抑制劑3-MA組HCMV AD169株病毒DNA拷貝數(shù)、HCMV pp65蛋白表達(dá)量及病毒滴度均較正常對照組低。
　　3.在建立MCMV急性感染小鼠肺組織模型基礎(chǔ)上，透射電鏡檢測結(jié)果顯示，MCMV感染組小鼠肺組織可看見明顯細(xì)胞自噬改變;

10、Western檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，MCMV感染組LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)，結(jié)果表明MCMV急性感染促進(jìn)小鼠肺組織細(xì)胞自噬。
　　結(jié)論:
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)HCMV感染早期促進(jìn)宿主細(xì)胞自噬，感染晚期變?yōu)橐种扑拗骷?xì)胞自噬，而mTOR自噬信號通路參與其中。
　　2.本研究分別從分子、蛋白和細(xì)胞水平證實(shí)了促進(jìn)宿主細(xì)胞自噬可從一定程度上促進(jìn)HCMV增殖，抑制宿主細(xì)胞自噬可從一定程度上抑制HCMV增殖。
　　3.MCM