造血干細胞移植后巨細胞病毒感染和GVHD的研究.pdf

1、異基因造血干細胞移植是目前治療來源于造血干細胞的惡性克隆性疾病的重要治療手段,廣泛應用于臨床。移植后的巨細胞病毒感染,移植物抗宿主病等發(fā)生率和死亡率都很高,使得移植成功率降低。如何減輕這些移植后并發(fā)癥提高異基因造血干細胞移植的效率是目前血液病學家和免疫學家共同關心的問題。
　　 第一部分搶先治療異基因造血干細胞移植后巨細胞病毒感染的臨床分析
　　 [目的]回顧性研究異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)后搶先治療對巨

2、細胞病毒(CMV)感染的臨床意義。[方法]收集上海市第一人民醫(yī)院2001-2008年間進行異基因干細胞移植治療的患者共計103例,采用熒光定量PCR法檢測CMV-DNA,并根據(jù)結(jié)果搶先治療CMV相關疾病,分析搶先治療對于阻止CMV血癥發(fā)展為CMV相關疾病的意義。[結(jié)果]103例患者中檢測出63例次(51例)CMV-DNA陽性,發(fā)生率為49.5％,經(jīng)搶先治療19例發(fā)生CMV相關疾病,發(fā)生率為18.4％。60例次CMV血癥經(jīng)更昔洛韋和(或)

3、鱗甲酸治療轉(zhuǎn)陰,1例不可評價療效,治療的總有效率為96.8％(60/62)。CMV相關疾病的治療總有效率為89.5％(17/19),2例患者因CMV相關肺炎伴急性移植物抗宿主病(aGVHD)而死亡,CMV相關疾病的直接死亡率為1.9％(2/103)。[結(jié)論]在不進行預防性治療的前提下,CMV血癥和CMV相關疾病發(fā)生率未見升高。
　　 第二部分抗原特異性記憶T細胞不引起GVHD及其機制研究
　　 [目的]移植物抗宿主病是異

4、基因造血干細胞移植后的另一種常見并發(fā)癥,由供者T淋巴細胞介導,其發(fā)病率和死亡率都很高,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。如何在減輕GVHD的同時保存T細胞的GVL功能是目前研究的熱點。幾個研究小組都證實非抗原特異性記憶T細胞不引起GVHD,然而對于抗原特異性記憶T細胞在GVHD中的作用卻少有研究。本實驗目的即為研究抗議特異性記憶T細胞在GVHD中的作用。[方法]建立野生型動物模型和轉(zhuǎn)基因動物模型來研究抗原特異性記憶T細胞在GVHD中的作用。應用T

5、Ea→CB6目的GVHD模型研究抗原特異性記憶T細胞不引起GVHD的機制。[結(jié)果]建立了兩種野生型動物模型,第一個模型是用BALB/c小鼠致敏C57BL/6小鼠,8周后從C57BL/6小鼠分選出CD62L-TEM移植給BALB/c受鼠,與CD62L+初始T細胞相比,CD62L-TEM細胞引起較弱的GVHD。第二個模型是用C3H/HeJ小鼠致敏C57BL/6小鼠使其受孕,從C57BL/6懷孕母鼠體內(nèi)分選出的記憶T細胞移植給C3H/HeJ小

6、鼠也只能引起較弱的GVHD。用轉(zhuǎn)基因的TEa小鼠建立了TEa→CB6目的GVHD模型,TEa小鼠中大部分T細胞為CD4+T細胞,特異性識別ASFEAQGALANIAVDKA肽段,此肽段表達在CB6F1小鼠細胞上。將初始TEa細胞轉(zhuǎn)輸至Rag-1-/-小鼠體內(nèi),然后用CB6F1小鼠的脾細胞進行免疫,8周后轉(zhuǎn)輸?shù)腡Ea細胞獲得記憶T細胞表型(即CD44highCD45RB-CD127+CD11abright FasL bright Ki67

7、-CD28-KLRG-),其中93％為CD62L-CD44high TEM表型,7％為CD62L+CD44high TCM表型。將TEM細胞純化出來,與抗原特異性T細胞或特異性抗原肽進行混合淋巴細胞反應。并觀察抗原特異性T細胞是否引起GVHD,同時進行異基因抗原皮膚移植,對抗原特異性記憶T細胞進行體內(nèi)追蹤。TEM細胞cpm值明顯高于初始TEa細胞,TEM細胞增殖更快更強。如果移植CB6F1小鼠皮膚到產(chǎn)生TEM細胞的Rag-1-/-小鼠(

8、TEM小鼠),TEM組皮膚移植物于7天至12天排斥,中位生存時間為9天；初始TEa動物組皮膚移植物7天至23天排斥,中位生存時間為10天,兩組生存率比較差異顯著(p<0.05)。為了研究TEM在GVHD中的作用,將1×105TEM細胞與1×107去除T細胞的骨髓一同移植至致死量照射的CB6F1受鼠,生存分析表明接受TEM細胞移植組小鼠100天生存率100％,而初始TEa組小鼠35天內(nèi)全部死亡,兩組生存率有明顯差異；體重變化曲線顯示在第7

9、、14及21天初始TEa受鼠組與TEM受鼠組相比體重下降明顯(p<0.01)。移植后第7天進行細胞因子檢測,接受初始TEa細胞移植的GVHD受鼠血漿中IL-2、IL-3、IL-12P40、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、IL-1a、IL-1b、MIP-1a、MIP-1b、RANTE、MCP-1、KC、Eotaxin、G-CSF和GM-CSF的水平明顯高于接受TEM細胞移植的GVHD受鼠(p<

10、0.05)。體外混合淋巴細胞培養(yǎng)顯示TEM在培養(yǎng)的前期cpm值高于初始TEa細胞,而培養(yǎng)后期TEM的cpm值低于初始TEa。CFSE標記效應細胞后進行AnnexinV和7-AAD流式檢測發(fā)現(xiàn),TEM細胞與初始T細胞相比早期凋亡與晚期凋亡均顯著增加,這種趨勢不依賴于IL-7的存在。對移植到CB6F1小鼠體內(nèi)的TEM細胞進行追蹤,分別收集骨髓,肝,脾及淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴細胞,移植后7天檢測不到TEM細胞,相反能夠檢測到大量的初始T細胞；與此相對