AGEs通過誘導巨噬細胞自噬影響糖尿病創(chuàng)面愈合的機制研究.pdf

1、研究背景：
　　皮膚的創(chuàng)傷愈合是對損傷組織復雜、動態(tài)的修復過程，一般包括炎癥反應期，細胞增殖期和重塑期三個相互重疊的時期。多種因素可以影響創(chuàng)面的修復，如血管神經病變、機體營養(yǎng)狀態(tài)、感染、藥物、免疫功能障礙等。糖尿病導致的難愈創(chuàng)面是臨床常見的慢性創(chuàng)面之一。糖尿病慢性創(chuàng)面的形成是一個多因素共同作用的結果，其致病機制仍不完全明確。糖尿病狀態(tài)下，體內蓄積的糖基化終末產物（advanced glycation end products，AG

2、Es）可通過抑制調節(jié)細胞、修復細胞和細胞外基質的功能從而影響創(chuàng)面愈合的各個階段，最終導致創(chuàng)面的難愈。盡管大量的研究聚焦于對糖尿病創(chuàng)面的治療，然而糖尿病難愈創(chuàng)面形成的潛在機制仍不明確。自噬是細胞通過溶酶體系統對胞內積聚的蛋白質和受損細胞器進行降解，然后再利用的代謝途徑，是細胞維持自身穩(wěn)態(tài)和存活的機制之一。臨床研究已證實免疫抑制劑雷帕霉素治療移植后抗排斥反應時，能夠導致患者創(chuàng)面的愈合延遲，同時雷帕霉素被認為是經典的自噬誘導劑，這表明自噬可能

3、與創(chuàng)面的愈合過程相關。本研究擬通過建立小鼠背部皮膚創(chuàng)面模型探討自噬在糖尿病慢性創(chuàng)面形成中的作用，并進一步通過體外實驗闡明AGEs誘導的自噬導致創(chuàng)面愈合延遲的機制。
　　目的：
　　闡明自噬對糖尿病創(chuàng)面愈合的影響和作用，并探討其可能的分子機制。
　　方法：
　　第一部分：構建C57BL/6小鼠全層皮膚缺損模型，采用免疫組化和免疫熒光技術檢測創(chuàng)面愈合過程各時相點（d0,d1,d3,d7,d14,d21）LC3和Bec

4、lin-1的表達，觀察自噬在創(chuàng)面愈合中的變化。同時，應用電鏡觀察創(chuàng)面自噬體的數量和結構；通過小鼠腹腔注射雷帕霉素和3-MA，觀察自噬增強或抑制后對創(chuàng)面愈合的影響；建立db/db糖尿病小鼠及db/m對照組小鼠全層皮膚創(chuàng)面模型，應用3-MA干預db/db糖尿病小鼠，觀察各組小鼠創(chuàng)面愈合時間，并通過免疫組化和免疫熒光技術檢測LC3在各組小鼠創(chuàng)面中的表達差異。同時，收集臨床糖尿病和非糖尿病患者的正常組織（各5例）及慢性創(chuàng)面組織（糖尿病患者44例

5、，非糖尿病患者20例），通過免疫組化技術檢測創(chuàng)面LC3的表達。
　　第二部分：構建C57BL/6小鼠全層皮膚缺損模型，經皮膚創(chuàng)緣注射AGEs，觀察創(chuàng)面愈合時間，應用免疫組化方法檢測創(chuàng)面愈合過程中（d0，d3，d7，d14）LC3的表達。另外，在AGEs創(chuàng)緣注射的同時腹腔注射3-MA，觀察創(chuàng)面的愈合情況，并應用免疫熒光和激光共聚焦觀察LC3的細胞定位。分別用雷帕霉素和3-MA處理RAW264.7細胞，通過western blot技術

6、觀察巨噬細胞LC3的改變，流式細胞學技術檢測巨噬細胞膜標記物CD11c（M1）和CD206（M2）的表達，并利用real-time PCR技術檢測巨噬細胞M1或M2相關細胞因子的表達。應用AGEs或者AGEs和3-MA同時干預RAW264.7細胞，通過電鏡觀察細胞自噬體變化，應用western blot技術觀察巨噬細胞LC3的改變，利用流式細胞學和real-time PCR技術檢測巨噬細胞的極化。
　　第三部分：構建shIRF8干

7、擾的RAW264.7細胞株，AGEs干預RAW264.7以及shIRF8細胞株，通過應用western blot、免疫熒光和激光共聚焦觀察巨噬細胞LC3的改變，并通過real-time PCR技術檢測巨噬細胞極化的改變。
　　結果：
　　第一部分：LC3和Beclin1在小鼠皮膚創(chuàng)面中均有表達，且創(chuàng)傷后表達均逐漸增多，d7、d14表達最高，以后逐漸減少，d21基本恢復正常；雷帕霉素能夠明顯增加LC3的表達，而3-MA抑制LC

8、3的表達。電鏡觀察自噬小體的數量在d7明顯增加。雷帕霉素組小鼠創(chuàng)面愈合明顯延遲，同時應用3-MA干預小鼠后，創(chuàng)面愈合加快；db/db小鼠較對照組db/m小鼠創(chuàng)面愈合時間明顯延遲（25.8?0.59 vs15.9?0.82 d），經腹腔注射3-MA后創(chuàng)面愈合速度加快，但仍遲于db/m組小鼠。db/db組小鼠創(chuàng)面LC3表達在各時間點均高于對照組小鼠；糖尿病患者慢性創(chuàng)面組織中LC3的表達明顯高于非糖尿病創(chuàng)面組織。
　　第二部分：AGEs

9、組小鼠較對照組創(chuàng)面愈合時間明顯延遲（18.0?0.67 vs14.8?0.79 d），3-MA與AGEs同時干預組小鼠愈合時間較AGEs組加快（15.0?0.82 d），但仍遲于對照組小鼠。AGEs組小鼠創(chuàng)面LC3表達在各時間點均高于對照組小鼠，d7、d14明顯增高。通過免疫熒光和激光共聚焦技術證實大部分LC3的表達與F4/80發(fā)生共定位染色。細胞實驗結果證實AGEs能夠增強RAW264.7細胞LC3的表達，同時電鏡結果顯示自噬體增多。

10、雷帕霉素能夠增強巨噬細胞 LC3的表達，并增加M1巨噬細胞標記物CD11c的陽性細胞數（27.86±1.37%vs13.61±10.97%），而3-MA能夠抑制LC3的表達，并且分別減少CD11c陽性細胞數。并且；雷帕霉素和3-MA分別能夠增加和減少tnf-a、il-1b、il-6、inos的表達（M1相關細胞因子），而對M2相關的細胞因子的影響不明顯。AGEs可以增加CD11c陽性的巨噬細胞數量（28.11±0.87%），并促進tnf

11、-a、il-1b、il-6、inos等細胞因子，而3-MA能夠抑制AGEs的作用。
　　第三部分：RAW264.7巨噬細胞經shIRF8干擾后，AGEs對LC3的誘導受到抑制，并且shIRF8阻斷了AGEs對tnf-a、il-1b、il-6、inos等M1相關炎癥因子的的促進作用。
　　結論：
　　1.糖尿病小鼠和糖尿病患者皮膚創(chuàng)面自噬增強與創(chuàng)面的愈合延遲相關；
　　2. AGEs通過誘導巨噬細胞自噬促進M1的極