普萘洛爾對糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的影響及其機理研究.pdf

1、研究目的:糖尿病慢性潰瘍是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一。糖尿病慢性潰瘍治療困難，一直是臨床工作的一大挑戰(zhàn)，易并發(fā)感染，感染嚴重的會導致截肢甚至死亡。糖尿病潰瘍普遍存在著上皮化緩慢、血管神經受損等問題。因此，研究糖尿病皮膚慢性潰瘍難愈的機制，發(fā)現促進愈合的關鍵因素，尋求經濟有效的治療手段非常必要。
　　課題組前期研究發(fā)現，自發(fā)性糖尿病小鼠和野生型正常小鼠皮膚組織結構有較大差異，自發(fā)性糖尿病小鼠皮膚中交感神經特異性標志物酪氨酸羥化酶的表達

2、顯著高于正常小鼠，在創(chuàng)面形成后正常小鼠酪氨酸羥化酶的表達迅速增高而后回落至正常水平，而糖尿病小鼠愈合過程中酪氨酸羥化酶升高延遲。酪氨酸羥化酶蛋白水平表達增高時，兒茶酚胺類物質增加，糖尿病小鼠炎癥期時間延長，從而導致創(chuàng)面愈合整個過程的減慢。有研究表明，創(chuàng)傷和應激導致血液及組織中兒茶酚胺升高，而高水平的兒茶酚胺抑制創(chuàng)面的愈合。普萘洛爾作為一種非選擇性的β受體阻滯劑，它最早用于心血管疾病治療，具有拮抗交感神經興奮和兒茶酚胺的作用。對小兒燒傷患

3、者住院期間予以普萘洛爾治療能減輕代謝亢進并逆轉肌肉蛋白質的分解代謝，促進燒傷創(chuàng)面愈合。本研究在前期工作基礎上，使用非選擇性β受體阻滯劑普萘洛爾對正常小鼠及自發(fā)性糖尿病小鼠進行處理，抑制交感神經活動，制作創(chuàng)面模型，觀察小鼠創(chuàng)面愈合情況，重點檢測自發(fā)性糖尿病小鼠β受體阻滯劑普萘洛爾處理后創(chuàng)面愈合情況，探討β腎上腺素受體阻滯劑對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面愈合的作用。
　　研究方法:1.普萘洛爾對正常小鼠創(chuàng)面愈合的影響:雌性C57BL/6J小鼠2

4、0只，分為兩組，每組10只。普萘洛爾組予50mg普萘洛爾溶于100ml飲水中，對照組正常飲水，持續(xù)給藥1周后在小鼠背部制作全層皮膚缺損創(chuàng)面。創(chuàng)面制作后普萘洛爾組繼續(xù)給藥直至安樂死。創(chuàng)面形成后1d、3d、5d、7d、10d數碼相機拍照，觀察創(chuàng)面愈合情況，測量創(chuàng)面的面積并計算創(chuàng)面愈合率;HE染色觀察創(chuàng)面組織再上皮化、炎癥反應、肉芽生長及新生血管等情況，組織學評分進行比較。
　　2.普萘洛爾對糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的影響:雌性糖尿病小鼠18

5、只，分為兩組，每組9只。在糖尿病小鼠背部制作全層皮膚缺損創(chuàng)面。普萘洛爾組及對照組創(chuàng)面分別外用涂抹普萘洛爾乳膏及乳膏基質（除了不含普萘洛爾，乳膏基質成分與普萘洛爾組乳膏成分完全一致）。創(chuàng)面形成后2d、5d、7d、10d、14d、17d換藥，換藥時普萘洛爾組及對照組創(chuàng)面再次分別涂抹普萘洛爾乳膏及乳膏基質，數碼相機拍照，并隨機抽取一只小鼠取材。測量創(chuàng)面的面積并計算創(chuàng)面愈合率，21d剩余3只糖尿病小鼠全部處死取材。HE染色、Masson染色、甲

6、苯胺藍染色分別觀察創(chuàng)面的再上皮化、膠原纖維及肥大細胞情況;PCNA、CD68免疫組化查看細胞增殖及巨噬細胞浸潤情況。Western blot檢測創(chuàng)面組織中PCNA、白細胞介素-1β(IL-1β)、血管生成素2(Ang2)、MMP-9的表達。
　　研究結果:1.正常小鼠創(chuàng)面形成后1d、3d、5d、7d創(chuàng)面愈合率比較，普萘洛爾組均高于對照組，在3d、5d比較，p＜0.05有明顯差異，而1d、7d比較，p＞0.05;10d兩組創(chuàng)面均完全

7、愈合。創(chuàng)面HE染色可見，組織學評分發(fā)現普萘洛爾組早期創(chuàng)面再上皮化及肉芽組織生長均高于對照組，而新生血管無明顯差異。
　　2.糖尿病小鼠創(chuàng)面形成后2d、5d、7d、10d、14d、17d創(chuàng)面愈合率比較，普萘洛爾組均高于對照組，且p＜0.05;創(chuàng)面形成后第21d，普萘洛爾組已經愈合，對照組未完全愈合，p＞0.05。HE染色，普萘洛爾組的再上皮化速度明顯快于對照組，早期階段炎癥浸潤較明顯，后期較弱。Masson染色提示普萘洛爾組與對照組

8、膠原表達量及膠原排列情況差異不明顯。甲苯胺藍染色，兩組創(chuàng)面組織內肥大細胞均分布較少。PCNA免疫組化結果顯示普萘洛爾組早期角質形成細胞增殖明顯增加。CD68結果顯示，普萘洛爾組創(chuàng)面組織早期有巨噬細胞浸潤表達而后期表達不明顯;對照組創(chuàng)面組織早期巨噬細胞表達不明顯而后期明顯表達。Western blot結果顯示普萘洛爾組IL-1β、Ang2表達均低于對照組，P＜0.05;2d普萘洛爾組PCNA表達高于對照組;普萘洛爾組MMP-9表達在2d、