糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合中MIP-2、MCP-1變化及機(jī)理研究.pdf

1、研究背景：炎癥反應(yīng)的“失調(diào)控”在糖尿病創(chuàng)面延遲愈合中的作用越來越受到重視，前期研究發(fā)現(xiàn)：在糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合過程中，糖尿病組（DM 組）創(chuàng)面中性粒細(xì)胞（PMN）浸潤量于傷后3天前明顯低于正常小鼠組（NM 組），3天后，明顯高于后者。DM組創(chuàng)面巨噬細(xì)胞（M φ）浸潤量于傷后5天前明顯低于NM 組，5天后，明顯高于后者。糖尿病創(chuàng)面炎癥細(xì)胞的這種特征性變化可能是影響糖尿病創(chuàng)面愈合進(jìn)展的重要因素。那么趨化吸引PMN和M φ向創(chuàng)面遷移的兩個趨化因

2、子巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2（MIP-2）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）在創(chuàng)面愈合過程中是否也存在相應(yīng)的表達(dá)改變，而成為PMN和M φ浸潤紊亂的上游因素，最終導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面的延遲愈合？全身及局部高糖是糖尿病患者的一個重要特征，也是引起糖尿病多種并發(fā)癥的一個非常重要的因素，包括燒、創(chuàng)傷后的創(chuàng)面愈合不良，因此，高糖環(huán)境可能是引起趨化因子MIP-2、MCP-1 表達(dá)改變的重要因素之一。 本實驗首先應(yīng)用STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠做全層皮膚

3、剪切傷作為糖尿病創(chuàng)面模型，研究糖尿病創(chuàng)面愈合過程中，趨化因子MIP-2、MCP-1蛋白及mRNA表達(dá)，從而證明MIP-2、MCP-1在糖尿病創(chuàng)面表達(dá)是否與PMN、M φ浸入的變化具有相關(guān)性。再用高糖刺激體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，觀察高糖對其表達(dá)MIP-2、MCP-1的影響，驗證高糖環(huán)境是否可改變M φMIP-2、MCP-1的表達(dá)，從而推測高糖對創(chuàng)面MIP-2、MCP-1表達(dá)改變的影響。并就高糖－趨化因子－炎癥細(xì)胞在糖尿病創(chuàng)面延遲愈合過程

4、中的作用機(jī)制作初步的探討。 研究方法： 第一部分：C57BL/6小鼠70只，分為兩組：糖尿病組（DM 組）和正常對照組（NM組），每組35只，DM 組用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立糖尿病模型，NM 組注射等量的生理鹽水。麻醉后小鼠于背部脊柱正中部位切除0.8cm×0.8cm 大小的全層皮膚創(chuàng)面，包扎后分籠飼養(yǎng)，創(chuàng)面定期換藥，兩組動物均于制創(chuàng)后當(dāng)日以及制創(chuàng)后1d,3d,5d,7d,10d和14d觀察創(chuàng)面愈合情況，測算創(chuàng)面愈

5、合率，并于各時相點隨機(jī)取動物5只，處死后取創(chuàng)面標(biāo)本，用ELISA和RT-PCR 法測定創(chuàng)面標(biāo)本MIP-2和MCP-1的蛋白含量和mRNA 表達(dá)水平。 第二部分：體外實驗運(yùn)用PBS沖洗小鼠腹腔，收集腹腔沖洗液，離心，運(yùn)用貼壁法分離純化巨噬細(xì)胞，用HE、Giemsa染色法，鑒定細(xì)胞的純度。將所得小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分成兩組分別于接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)：高糖組（HG 組），以高糖型DMEM培養(yǎng)基（25.5mmol/L）培養(yǎng)，正常糖組（NG

6、組）以低糖型DMEM 培養(yǎng)基（5.5mmol/L）培養(yǎng)，0、2、4、8、12、24、48小時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞，用ELISA和RT-PCR 法檢測兩組細(xì)胞在各時相點MIP-2、MCP-1 培養(yǎng)上清的蛋白含量和細(xì)胞mRNA的表達(dá)。所得結(jié)果作統(tǒng)計學(xué)分析。 研究結(jié)果: 1.STZ 誘導(dǎo)的DM 鼠模型，具有典型的“三高一低”臨床癥狀，血糖、體重檢測指標(biāo)符合DM動物模型的標(biāo)準(zhǔn)。 2.DM組小鼠在傷后3d 起各時相點創(chuàng)

7、面愈合率均明顯低于NM組小鼠。 3.NM組的MIP-2表達(dá)于傷后第1d即達(dá)峰值（262.3±24.2pg/ml），以后逐漸下降，傷后10d基本恢復(fù)到傷前水平；DM組MIP-2的表達(dá)高峰也在傷后第1d（176.3±24.8pg/ml），但峰值較NM組低（P<0.01），傷后第3d兩組小鼠創(chuàng)面MIP-2的表達(dá)量基本相等，DM組于傷后5d及以后的各時相點，均明顯高于NM組（P<0.01），即使在傷后14d，仍維持在較高水平（與傷前比P

8、<0.01）。 4.NM 組的MCP-1蛋白表達(dá)于傷后1d峰值，（178.9±58.3pg/ml），之后逐漸下降，至傷后第10d基本降至傷前水平。DM組MCP-1的表達(dá)在傷后第1d為141.0±5.0，低于NM組（P<0.05），傷后第3d達(dá)到峰值（210.6±5.0pg/ml），以后也漸下降，但各時相點與NM組相比，仍維持一個較高的水平（P<0.01）,至傷后第14d 仍略高于傷前水平（P<0.05）。 5.NM和DM

9、組趨化因子MIP-2、MCP-1mRNA和蛋白表達(dá)水平在各時相點的變化趨勢基本一致。 6.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)純化后，鏡下觀察可見貼壁細(xì)胞大小較均勻，呈圓形或橢圓形，培養(yǎng)6-8小時后，可見部分細(xì)胞有偽足和突起形成，呈多角形或不規(guī)則形，臺盼藍(lán)染色證明，細(xì)胞培養(yǎng)5天后，細(xì)胞活力仍大于93％。 7.巨噬細(xì)胞經(jīng)HE和Giemsa 染色后，有鈍圓形突起，胞漿豐富，胞核較大，染色較深，多呈腎形、馬蹄形或不規(guī)則形，純度大于95％。

10、 8.NG 組MIP-2的mRNA 水平在各時相點均無明顯差異，而在HG組，細(xì)胞培養(yǎng)4小時后MIP-2的表達(dá)明顯增高，8小時略有下降，與NG組相比，明顯高于NG 組（P<0.01），12小時后開始明顯下降，但均高于相應(yīng)NG組的表達(dá)水平（P<0.05），兩組細(xì)胞MIP-2mNRA的表達(dá)變化趨勢類似其蛋白水平的變化。 9.NG 組MCP-1的mRNA水平在各時相點均無明顯差異，而在HG組，細(xì)胞培養(yǎng)4小時后MCP-1的表達(dá)開始增高，

11、4小時和8小時MCP-1的mRNA的表達(dá)水平高于HG 組（P<0.05）；12小時達(dá)高峰，明顯高于NG組，24和48小時雖略有下降，但與NG組相比，仍明顯高于NG組（P<0.01），兩組細(xì)胞MCP-1mNRA的表達(dá)變化趨勢基本類似其蛋白水平的變化。 10.兩組細(xì)胞趨化因子MIP-2和MCP-1mRNA和蛋白表達(dá)水平在各時相點的變化趨勢基本一致。 結(jié)論： 1.在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中存在趨化因子MIP-2、MCP-1

12、的表達(dá)異常。 2.MIP-2、MCP-1在各時相點的表達(dá)改變與PMN和M φ在糖尿創(chuàng)面的變化趨勢基本一致。 3.趨化因子MIP-2、MCP-1的紊亂表達(dá)及在創(chuàng)面的持續(xù)存在可能是糖尿病創(chuàng)面延遲愈合的一個重要環(huán)節(jié)。 4.體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對趨化因子MIP-2、MCP-1均有表達(dá)。 5.高糖可使體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對MIP-2、MCP-1蛋白和mRNA的表達(dá)明顯增加。 6.在糖尿病創(chuàng)面，高糖