皮膚源祖細(xì)胞-透明質(zhì)酸復(fù)合物對(duì)糖尿病創(chuàng)面愈合的影響.pdf

1、糖尿病是臨床的常見(jiàn)病、多發(fā)病，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平和人民生活水平的不斷提高，糖尿病的發(fā)病率越來(lái)越呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，而糖尿病慢性創(chuàng)面不愈的問(wèn)題則愈發(fā)突出。降低糖尿病慢性創(chuàng)面的發(fā)病率、促進(jìn)創(chuàng)面愈合和減少截肢率不但能提高糖尿病患者的生活質(zhì)量，而且能為降低社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)提供重大的現(xiàn)實(shí)意義。慢性創(chuàng)面不愈是糖尿病主要的并發(fā)癥之一，每年用于治療糖尿病足及其它慢性創(chuàng)面的費(fèi)用，僅美國(guó)一年就高達(dá)150億美元。難愈性創(chuàng)面是引起截肢的最主要原因，84﹪的糖尿病患者是

2、因?yàn)樘悄虿÷詣?chuàng)面引發(fā)截肢的。通常認(rèn)為組織循環(huán)障礙和血管再生異常是糖尿病皮膚創(chuàng)面形成并且愈合延遲的主要原因，臨床實(shí)踐證明改善微循環(huán)有利于促進(jìn)糖尿病患者創(chuàng)面的修復(fù)。另外感覺(jué)神經(jīng)功能異常也是阻礙糖尿病創(chuàng)面愈合的重要原因，然而具體發(fā)病機(jī)制卻不完全明了。目前糖尿病創(chuàng)面的治療主要集中在清創(chuàng)、降低創(chuàng)面壓力、防治感染和創(chuàng)面濕潤(rùn)環(huán)境的維持上面。但是這種治療方法對(duì)局部組織有可能造成進(jìn)一步的損傷，而且對(duì)糖尿病創(chuàng)面所致的截肢率并沒(méi)有明顯的降低。 目前

3、有學(xué)者用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和其它一些成體干細(xì)胞應(yīng)用于糖尿病慢性創(chuàng)面的修復(fù)研究當(dāng)中。本課題組從2000年開(kāi)始系統(tǒng)研究組織工程皮膚的構(gòu)建，成功地分離、培養(yǎng)出人皮膚源祖細(xì)胞，研制出血漿真皮再生模板，并初步完成人皮膚源祖細(xì)胞復(fù)合血漿真皮再生模板構(gòu)建組織工程皮肽的工作。在此基礎(chǔ)上，本次課題通過(guò)將構(gòu)建的皮膚源祖細(xì)胞一透明質(zhì)酸復(fù)合物應(yīng)用于糖尿病大鼠創(chuàng)面治療，以觀察皮膚源祖細(xì)胞對(duì)糖尿病創(chuàng)面血管和神經(jīng)再生的情況。第一部分皮膚源祖細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定和體外誘導(dǎo)目

4、的探討皮膚源祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)、鑒定及定向誘導(dǎo)成脂、成骨的方法，為組織工程骨和組織工程皮膚構(gòu)建提供理想的種子細(xì)胞。方法取出生1～3d的SD大鼠幼鼠皮膚，以含表皮生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，描繪生長(zhǎng)曲線；免疫熒光鑒定細(xì)胞表達(dá)Nestin和Fibronectin情況；取第3代細(xì)胞，分別用成脂和成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)14d，以油紅0染色、茜素紅染色和免疫熒光檢測(cè)皮膚源祖細(xì)胞誘導(dǎo)成脂、成骨情況。結(jié)果細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，迅速

5、增殖形成克隆球團(tuán)；細(xì)胞免疫熒光表達(dá)Nestin和Fibronectin；成脂誘導(dǎo)14d后，細(xì)胞內(nèi)大量致密顆粒形成，油紅0染色可見(jiàn)紅色脂滴；成骨誘導(dǎo)14d后，茜素紅染色可見(jiàn)暗紅色鈣鹽沉積，骨橋蛋白表達(dá)陽(yáng)性顯示成骨細(xì)胞形成。結(jié)論皮膚源祖細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性，能分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，可作為組織工程骨和組織工程皮膚的種子細(xì)胞。 第二部分皮膚源祖細(xì)胞與透明質(zhì)酸體外組織相容性的研究目的探討透明質(zhì)酸凝膠作為皮膚源祖細(xì)胞載體的可行性。方法將

6、含第3代皮膚源祖細(xì)胞2.0×10<'4>個(gè)的懸液0.5ml加入到0.5ml的透明質(zhì)酸凝膠中，通過(guò)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，載體的親水性及對(duì)細(xì)胞的粘附力；收集與透明質(zhì)酸共培養(yǎng)的皮膚源祖細(xì)胞，描繪生長(zhǎng)曲線，觀察細(xì)胞在含10﹪血清的培養(yǎng)基中分化的情況；利用流式細(xì)胞儀檢查比較共培養(yǎng)細(xì)胞與第3代皮膚源祖細(xì)胞的抗原表達(dá)、細(xì)胞周期和細(xì)胞活力，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果皮膚源祖細(xì)胞在透明質(zhì)酸凝膠中呈均勻散在分布；在載體中皮膚源祖細(xì)胞保持低倍增狀態(tài)，并保持

7、分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的潛能；共培養(yǎng)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Nestin和Fibrotlectin的細(xì)胞為(88.58±2.99)﹪，細(xì)胞活力檢測(cè)為(93.40±1.13)﹪，與對(duì)照組基本相似；共培養(yǎng)后細(xì)胞周期G<,0>／G<,1>細(xì)胞為(91.65±1.08)﹪，明顯高于對(duì)照組。結(jié)論透明質(zhì)酸與皮肽源祖細(xì)胞具有較好的組織相容性，對(duì)于皮膚源祖細(xì)胞的增殖及多分化潛能的維持，有利于透明質(zhì)酸成為皮膚源祖細(xì)胞的載體界面，并為皮膚源祖細(xì)胞應(yīng)用于創(chuàng)

8、面移植創(chuàng)造了條件。第三部分皮膚源祖細(xì)胞一透明質(zhì)酸復(fù)合物對(duì)糖尿病創(chuàng)面愈合的影響目的探討皮膚源祖細(xì)胞(SKPs)一透明質(zhì)酸(HA)復(fù)合物的構(gòu)建，觀察SKPs-HA復(fù)合物對(duì)糖尿病(DM)皮膚創(chuàng)面愈合的影響。方法分離培養(yǎng)SD大鼠SKPs，CM-DiI標(biāo)記后以HA為載體構(gòu)建復(fù)合物；60只SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)成DM模型，背部制作全層皮膚缺損創(chuàng)面，隨機(jī)分為SKPs-HA復(fù)合物處理組(A組)、HA處理組(B組)和DMEM/F12培養(yǎng)

9、基組作為空白對(duì)照(C組)，各組大鼠于治療后1w、2w、3w和4 w留取創(chuàng)面組織標(biāo)本，對(duì)創(chuàng)面愈合率、組織形態(tài)學(xué)改變、創(chuàng)面組織羥脯氨酸(HYP)含量、血管和神經(jīng)再生進(jìn)行檢測(cè)，并觀察SKPs在創(chuàng)面愈合過(guò)程中的遷移情況，生物力學(xué)檢測(cè)愈合皮膚的彈性和韌性。結(jié)果A組和B組較c組更早出現(xiàn)創(chuàng)面上皮爬行，炎癥反應(yīng)較輕；A、B組愈合速度、愈合后表皮層厚度均高于C組，膠原排列更加規(guī)則有序；3w時(shí)，A組愈合率為(90.06±2.50)﹪，B組愈合率為(76.0

10、5±4.26)﹪，C組愈合率為(63.42±3.27)﹪，4w時(shí)A、B組完全愈合，C組愈合率為(94.20±1.36)﹪，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組HYP含量2w為(18.74±0.30)μg/mg，3w為(17.72±0.64)μg/mg，4w為(16.38±0.52)μg/mg，均高于C組；A組2w、4w血管密度分別為(39.65±3.56)個(gè)/mm<'2>和(58.46±7.49)個(gè)/mm<'2>，高于其他2組；神經(jīng)再

11、生主要發(fā)生于真皮層，表皮層較少，再生神經(jīng)密度依次為：A組>B組>C組；SKPs在創(chuàng)面存活并隨時(shí)間向真皮層遷移；生物力學(xué)檢測(cè)：在相同外力作用下，皮膚長(zhǎng)度變化依次為對(duì)照組<透明質(zhì)酸組<皮膚源祖細(xì)胞一透明質(zhì)酸組，最大斷裂力SKPs-HA組為(2.673±0.024)N，HA組為(1.745±0.027)N，對(duì)照組為(1.291±0.537)N，結(jié)果各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 SKPs-HA復(fù)合物可促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的血管形成和神經(jīng)再生，利于表