微針?biāo)缕つw創(chuàng)傷愈合對(duì)透明質(zhì)酸透皮能力的影響.pdf

1、目的：
　　目前微針經(jīng)皮給藥技術(shù)的研究集中于促滲作用，忽略了該方法所致創(chuàng)傷的愈合過(guò)程。本研究旨在探討微針?biāo)缕つw創(chuàng)傷的愈合過(guò)程，同時(shí)研究其愈合過(guò)程對(duì)透明質(zhì)酸經(jīng)皮滲透能力的影響。
　　方法：
　　1、剃除SD大鼠背部毛發(fā)，觀察皮膚出血情況；切取剃毛后全層皮膚修剪皮下組織，觀察修剪前后皮膚層次；取全層皮膚、修剪皮下組織前后皮膚和微針針刺后皮膚行HE染色，組織學(xué)觀察角質(zhì)層完整性、修剪層次和針刺深度。
　　2、用正交設(shè)計(jì)

2、軟件專業(yè)版V3.1設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以針頭型號(hào)G、透明質(zhì)酸分子量Mr、透皮時(shí)間T作為考察因素，每個(gè)因素4個(gè)水平，即針頭型號(hào)（無(wú)針頭、25G、22G、18G）、透明質(zhì)酸分子量（10kDa、100kDa、1000kDa、1500kDa）、透皮時(shí)間（1h、3h、5h、7h）。依據(jù)正交表L16(45)，獲得16組實(shí)驗(yàn)組合。
　　3、使用改良的Franz擴(kuò)散池進(jìn)行大鼠離體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)。用大鼠透明質(zhì)酸酶聯(lián)免疫試劑盒（Rat HA ELISA KIT）

3、測(cè)定每組實(shí)驗(yàn)樣品液內(nèi)的透明質(zhì)酸濃度，以每組實(shí)驗(yàn)樣品液的濃度減去相同透皮時(shí)間的空白對(duì)照組濃度作為考察指標(biāo)，篩選和優(yōu)化最佳實(shí)驗(yàn)組合“G-Mr-T”。
　　4、取3只已備皮的大鼠麻醉后，于脊柱兩側(cè)對(duì)稱部位畫直徑約1.5cm的圓圈，左右各三個(gè)，圓圈內(nèi)分別使用22G微針陣列和18G微針陣列穿刺，照相、肉眼觀察并記錄皮膚反應(yīng)及愈合情況。
　　5、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組：18只已備皮的SD大鼠，體重約180g，創(chuàng)傷愈合組織學(xué)觀察、鈣黃綠素染色和HA

4、經(jīng)皮滲透分別隨機(jī)抽取2只、6只和10只，腹腔注射水合氯醛（0.003mL·g-1）麻醉。按操作4進(jìn)行標(biāo)記，每2只大鼠的時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)如下：1只大鼠的左側(cè)圓圈由頭側(cè)向尾側(cè)分別設(shè)為0h、3h、6h，右側(cè)為9h、12h、15h，另1只的左側(cè)為18h、21h、24h，右側(cè)為正常對(duì)照、空白對(duì)照；微針針刺后，無(wú)菌紗布覆蓋，待其自然愈合，到每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后，取開紗布，分別進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)操作。
　　6、鈣黃綠素染色：用鈣黃綠素棉球覆蓋，避光染色10min，

5、取開棉球，用鹽水和酒精棉球交替擦拭各2遍，取全層皮膚稍微修剪皮下組織后置于載玻片， 立即在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)490nm，發(fā)射波長(zhǎng)515nm，統(tǒng)計(jì)光斑數(shù)，獲取熒光圖像。
　　7、創(chuàng)傷愈合組織學(xué)觀察：切取全層皮膚行HE染色，觀察組織學(xué)變化。
　　8、透明質(zhì)酸體內(nèi)經(jīng)皮滲透：涂抹透明質(zhì)酸4h，用PBS液濕棉簽擦去表面滯留的HA，取下全層皮膚，清洗后將全層皮膚和皮下肉膜層分開，分別勻漿，采用Rat HA ELISA

6、KIT測(cè)定透明質(zhì)酸濃度。
　　9、正交設(shè)計(jì)軟件V3.1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)分析。皮膚和肉膜中HA含量用x±s表示。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣本均數(shù)兩兩之間的比較用SNK-q檢驗(yàn)（n=5），P<0.05為差異有顯著性。多個(gè)樣本率的比較用卡方分割法，為保證檢驗(yàn)假設(shè)中I型錯(cuò)誤a的概率不變（a=0.05），須重新規(guī)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)a′（a′=a/2（k-1），其中a=0.05，k為實(shí)驗(yàn)組數(shù)），得出P<0.003

7、13為差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　1、脊柱兩側(cè)毛發(fā)剃除干凈，未見傷痕及出血點(diǎn)，角質(zhì)層、顆粒層、棘層、基底層及真皮層層次分明，角質(zhì)層完好無(wú)損，皮膚屏障結(jié)構(gòu)健全；修剪后皮膚未見肉眼可見皮下組織及破洞，皮下面完整光滑，完整保留真皮層；微針陣列針刺皮膚后，作用部位角質(zhì)層破壞，刺入深度達(dá)真皮乳頭層。
　　2、HA體外透皮正交實(shí)驗(yàn)中，針頭越粗、分子量越小、透皮時(shí)間越長(zhǎng)，HA的透過(guò)量越多（P＜0.05）?！?8G-10k-7h”

8、、“18G-100k-5h”、“22G-10k-5h”、“22G-100k-7h”組合的透過(guò)量（ng·L-1）分別為410.555、231.700、294.705、215.440，考慮分子量越大，其降解速度越慢，效果越持久，分子量定為100kDa；當(dāng)透皮時(shí)間在3～5h，其透皮速率最大，所以將透皮時(shí)間定為4h；而針頭型號(hào)在22G或18G中選擇，根據(jù)兩者的愈合過(guò)程擇優(yōu)而定。
　　3、肉眼觀：22G微針針刺后15h基本愈合，而18G延遲

9、到21h，兩種針型到24h基本恢復(fù)正常皮膚形態(tài)。因此，最優(yōu)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)組合確定為“22G-100k-4h”，選擇22G微針進(jìn)行在體鈣黃綠素染色、創(chuàng)傷愈合組織學(xué)觀察和透明質(zhì)酸透皮實(shí)驗(yàn)。
　　4、鈣黃綠素染色：22G微針針刺皮膚，經(jīng)過(guò)0h、3h、6h、9h、12h、15h的愈合過(guò)程后，行鈣黃綠素染色10min立即觀察，光斑個(gè)數(shù)小幅度減少，染色率分別為98.9％、97.8％、95.6％、94.4％、92.2％、91.1％，兩兩相比，染色率輕

10、度下降（P＞0.00313）；經(jīng)過(guò)18h、21h、24h的愈合過(guò)程后，光斑個(gè)數(shù)大幅度減少，染色率分別為3.3％、1.1％、2.2％，與0h相比，染色率大幅度降低（P＜0.00313）。隨著愈合時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光光斑輪廓逐漸變小，15h時(shí)微弱可見，18h已無(wú)熒光光斑。
　　5、創(chuàng)傷愈合組織學(xué)觀察：22G微針針刺后皮膚屏障破壞，深達(dá)真皮乳頭層，隨著愈合時(shí)間的延長(zhǎng)，微孔收縮，尺寸變小。到18h，微孔被增生的表皮細(xì)胞覆蓋，皮膚屏障結(jié)構(gòu)基本恢

11、復(fù)。
　　6、HA皮膚滯留量：正常對(duì)照組（無(wú)微針預(yù)處理的正常皮膚外用HA）皮膚HA含量與空白對(duì)照組（無(wú)微針預(yù)處理的正常皮膚外用PBS液）相同（P＞0.05）。22G微針針刺，分別經(jīng)過(guò)0h、3h、6h、9h、12h、15h愈合后，再涂抹HA，皮膚內(nèi)HA的含量均高于空白對(duì)照組（P＜0.05），且隨著愈合時(shí)間點(diǎn)的增加，皮膚HA的含量減少（P＜0.01）；而經(jīng)過(guò)18h、21h、24h的愈合時(shí)間后，再給予HA，皮膚內(nèi)HA的含量與空白對(duì)照組相

12、近（P＞0.05）。
　　7、HA肉膜滯留量：22G針刺后分別經(jīng)過(guò)0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h愈合后，再給予外用HA，肉膜層HA的含量與空白對(duì)照組相近（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、微針?biāo)缕つw創(chuàng)傷在24h內(nèi)愈合，皮膚屏障功能恢復(fù)。
　　2、22G微針針刺后HA（Mr=100kDa）的透皮量增加。隨著微創(chuàng)傷的愈合，其透過(guò)量逐漸減少，18h后，創(chuàng)傷愈合，皮膚屏障功能恢復(fù)，H