細(xì)胞自噬在糖尿病大鼠脊髓損傷中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:在糖尿病大鼠脊髓損傷中研究細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡的變化，并進(jìn)一步探討研究自噬與凋亡的關(guān)系;其次，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)明確自噬在高糖加重的氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞中所起的作用。
　　方法:采用STZ注射及血管夾脊髓夾閉損傷建立糖尿病脊髓損傷模型，隨機(jī)分組為假手術(shù)組，脊髓損傷組，糖尿病脊髓損傷組。術(shù)后第3，7，14，21及28天采用BBB評(píng)分及斜板試驗(yàn)對(duì)各組運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)估。術(shù)后第7天組織采用HE染色檢測(cè)脊髓損傷后組織學(xué)變化，采用尼氏染色及免疫組

2、化（標(biāo)記NeuN）檢測(cè)受損脊髓的神經(jīng)元丟失情況，采用免疫熒光染色（標(biāo)記CD45）及免疫組化染色（標(biāo)記CD68）檢測(cè)脊髓損傷后炎癥反應(yīng)情況，采用免疫組化染色（標(biāo)記GFAP）檢測(cè)損傷后星型膠質(zhì)細(xì)胞增生情況;采用免疫組化，熒光雙染(TUNEL/NeuN)及Western blot檢測(cè)各組凋亡水平變化;采用透射電鏡，免疫組化及Western blot檢測(cè)各組自噬水平變化。并進(jìn)一步采用自噬激動(dòng)劑處理糖尿病脊髓損傷組，觀察激活自噬對(duì)糖尿病大鼠脊髓損

3、傷后細(xì)胞凋亡，神經(jīng)性損傷及運(yùn)動(dòng)功能的影響。最后以氧化損傷的PC12細(xì)胞為體外模型，培育以含或不含雷帕霉素的高糖培養(yǎng)基，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力;采用免疫熒光，Western blot檢測(cè)自噬水平;采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色，TUNEL法及Western blot檢測(cè)凋亡水平。
　　結(jié)果:BBB評(píng)分及斜板試驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病延緩大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù);HE染色結(jié)果顯示糖尿病能加重大鼠受損脊髓組織形態(tài)學(xué)破壞;尼氏染色及免疫組化（標(biāo)記N

4、euN）結(jié)果顯示糖尿病顯著增加脊髓損傷后的神經(jīng)元丟失;免疫熒光染色（標(biāo)記CD45）及免疫組化染色（標(biāo)記CD68）結(jié)果顯示糖尿病增加脊髓損傷病灶的炎癥反應(yīng)，且免疫組化染色（標(biāo)記GFAP）結(jié)果反應(yīng)糖尿病能增強(qiáng)受損脊髓中的星型膠質(zhì)細(xì)胞增生。免疫組化，熒光雙染(TUNEL/NeuN)及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示糖尿病大鼠脊髓損傷組較脊髓損傷組的細(xì)胞凋亡水平顯著上升;透射電鏡，免疫組化及Western blot檢測(cè)顯示糖尿病能進(jìn)一步激活

5、脊髓損傷后的細(xì)胞自噬。利用雷帕霉素上調(diào)糖尿病大鼠脊髓損傷后的自噬水平后，運(yùn)動(dòng)功能得以改善，神經(jīng)性損傷明顯減輕及凋亡水平顯著下降。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在高糖環(huán)境下，氧化損傷后的PC12細(xì)胞活性明顯下降，凋亡和自噬水平顯著上升;雷帕霉素在體外上調(diào)自噬水平后，高糖誘導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡明顯下降，細(xì)胞活力顯著提高。
　　結(jié)論:1.STZ誘導(dǎo)的糖尿病能顯著加重大鼠脊髓損傷后的神經(jīng)元丟失，炎癥反應(yīng)及星型膠質(zhì)細(xì)胞增生，并抑制運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。于此同時(shí)