自噬在丙戊酸治療脊髓損傷中的作用研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinalcordinjury,SCI)是指由直接或間接外力損傷脊髓，在損害的相應(yīng)節(jié)段出現(xiàn)各種運(yùn)動(dòng)、感覺和括約肌功能障礙等，是致殘、致死率極高的危重性疾病。在當(dāng)今社會(huì)，隨著交通事故、礦井災(zāi)難、建筑事故及暴力傷害等使得脊髓損傷的人員逐年上升，給社會(huì)造成了的巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，患者的生活質(zhì)量明顯下降。
　　雖然對(duì)于脊髓損傷的治療有了很大的進(jìn)展，但是由于其發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，所以針對(duì)脊髓損傷的臨床治療特別是對(duì)其運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的治

2、療效果并不十分理想。因此，進(jìn)一步了解與脊髓損傷病情發(fā)展相關(guān)的機(jī)制及尋求更好更快捷的治療方法，提高患者的生活質(zhì)量是我們迫切需要關(guān)注的問題。
　　創(chuàng)傷后運(yùn)動(dòng)功能下降的機(jī)制有很多，目前也取得了很多的進(jìn)展。近年來，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后全身應(yīng)激反應(yīng)明顯，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)處于應(yīng)激狀態(tài)，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的自噬在其中發(fā)揮著重要的作用。自噬可以通過降解損傷的細(xì)胞器及蛋白來維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，但是其具有雙刃劍的作用。眾多研究表明，創(chuàng)傷引起的脊髓損傷后自噬是升高的，

3、而且影響脊髓功能的恢復(fù)。如果我們能夠掌握脊髓損傷過程中自噬表達(dá)的時(shí)間特征并對(duì)其進(jìn)行有效的調(diào)整，可能會(huì)對(duì)脊髓功能的恢復(fù)起到一定的治療作用，為脊髓損傷的治療提供新的方向。
　　對(duì)于自噬的治療，我們需要尋找一種抑制自噬，且同時(shí)不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷的方法。近年來發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶抑制劑在許多神經(jīng)疾病中具有保護(hù)作用。丙戊酸是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，有研究表明，在腫瘤組織中可以抑制自噬，提示這種藥物可能對(duì)于自噬具有一定的作用，那么這種作用

4、應(yīng)該會(huì)對(duì)脊髓損傷的恢復(fù)有幫助。
　　本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞研究?jī)蓚€(gè)方面開展了相關(guān)的工作。研究?jī)?nèi)容包括以下3個(gè)部分:
　　1觀察脊髓損傷后脊髓組織自噬的變化特征。
　　2觀察丙戊酸治療脊髓損傷后脊髓組織自噬及運(yùn)動(dòng)功能的變化。
　　3選用SH-SY5Y細(xì)胞，建立細(xì)胞損傷模型，將Beclin-1基因過表達(dá)，明確自噬在丙戊酸治療脊髓損傷中的作用。
　　第一部分大鼠脊髓損傷后脊髓組織自噬的表達(dá)特征研究目的
　　

5、建立大鼠脊髓挫傷模型，觀察脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)因子Beclin-1和LC3的蛋白及mRNA表達(dá)，明確脊髓損傷后自噬表達(dá)特征。從而為揭示繼發(fā)性脊髓損傷的可能機(jī)制提供研究條件，并奠定研究基礎(chǔ)。
　　研究方法
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　健康雄性Wistar大鼠，體重220~250g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　2.建立大鼠脊髓損傷模型：
　　脊髓損傷模型：應(yīng)用改良的NYUImpactor(脊髓損傷撞

6、擊儀)裝置造模法，即用10g重物從25mm的高度落下打擊脊髓背側(cè)造成不同程度的損傷，該模型與人類脊髓損傷的性質(zhì)非常相近，兩者均屬一定力量撞擊后造成脊髓水腫、缺血，并繼發(fā)一系列損傷反應(yīng)。以T10為標(biāo)志，暴露大鼠T9-11椎板，咬除T10的棘突及椎板，調(diào)整立體定位儀的立臂將沖擊桿對(duì)準(zhǔn)T10脊髓，將10g重的沖擊桿自25mm高度處下落撞擊脊髓，沖擊桿下落后大鼠迅速出現(xiàn)搖尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動(dòng)，表明撞擊成功。沖擊桿與脊髓的接觸面有輕微的凹

7、槽，以防止損傷脊膜。沖擊桿底部直徑為2.5mm，略小于脊髓直徑，當(dāng)它壓迫脊髓時(shí)能夠清楚的顯示椎管的邊緣
　　3.Real-timePCR及Westernblot標(biāo)本采集
　　假手術(shù)組術(shù)后立即取材，脊髓損傷大鼠術(shù)后1h、2h、6h、24h、48h、72h取材，每組分別取6只大鼠，麻醉后取出包含損傷中心長(zhǎng)約1cm的脊髓組織，立即置于-80℃冰箱保存，用于提取其總RNA及蛋白。
　　4.Westernblot測(cè)定LC3和Be

8、clin-1的蛋白含量
　　將脊髓組織勻漿、離心后取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制15％凝膠，上樣（上樣量LC3及Beclin-1均為40μg/孔）、電泳、轉(zhuǎn)膜（半干式）、封閉、經(jīng)過一抗、二抗反應(yīng)后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，利用ImagJ1.44p軟件進(jìn)行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。
　　5.Real-timePCR測(cè)定LC3和Beclin-1的mRN

9、A表達(dá)。
　　脊髓組織總RNA提取后，按照說明書將提取的RNA在一定的反應(yīng)體系及反轉(zhuǎn)錄條件下合成cDNA，然后取2ulcDNA與上游引物、下游引物、水及SYBR?PremixExTaqTM在Mx3005PReal-TimePCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，記錄Ct值、擴(kuò)增曲線及溶解曲線。并相對(duì)定量結(jié)果計(jì)算（2-ΔΔCt法）。
　　ΔCt目的基因=Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct對(duì)照組目的基因
　　ΔCtGAPDH=Ct實(shí)驗(yàn)組GAPDH-Ct

10、對(duì)照組GAPDH
　　-ΔΔCt=-(ΔCt目的基因-ΔCtGAPDH)
　　6.免疫熒光染色
　　脊髓損傷后2h，損傷中心冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色，經(jīng)過洗片、封閉之后，孵育一抗Anti-LC3和Anti-Beclin-14℃冰箱過夜，洗片后孵育相應(yīng)的山羊抗小鼠或山羊抗兔的熒光二抗，再次洗片后DAPI染色3min，洗片，封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。
　　7.統(tǒng)計(jì)處理
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±S

11、D）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。*P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1脊髓損傷大鼠模型建立成功
　　所有大鼠在術(shù)后都得以存活。SCI前、術(shù)后2h、術(shù)后24h，生理學(xué)參數(shù)（包括平均動(dòng)脈血壓，PH值，體溫，血?dú)夥治?，血糖）在脊髓損傷組和VPA治療組沒有明顯的不同。（見表1）。10g重的沖擊桿從自25mm高度處以自由

12、落體落下，金屬桿下落后大鼠迅速出現(xiàn)搖尾反射，雙后肢及軀體回縮撲動(dòng)，表明撞擊成功。
　　2脊髓損傷后脊髓組織自噬表達(dá)增高
　　大鼠胸椎T10挫傷后，在不同的時(shí)間點(diǎn)脊髓組織自噬的表達(dá)發(fā)生了明顯的變化。通過Westernblot和Real-timePCR法檢測(cè)了LC3和Beclin-1的蛋白及mRNA水平的表達(dá)。自脊髓損傷后1h開始自噬標(biāo)記物Beclin-1和LC3的蛋白及mRNA表達(dá)就開始增加，在損傷后1h，2h，6h其差異具有

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p<0.05），并且其表達(dá)水平在損傷后2h達(dá)到高峰(**p<0.01)。(見圖1-4)
　　3脊髓損傷促進(jìn)了LC3及Beclin-1的免疫熒光表達(dá)
　　脊髓損傷后2h，通過激光共聚焦顯微鏡觀察LC3及Beclin-1的免疫熒光表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與假手術(shù)（sham組）相比，脊髓損傷后脊髓組織LC3及Beclin-1的蛋白聚點(diǎn)增加，表示其表達(dá)增加。
　　小結(jié)
　　脊髓損傷后脊髓組織中自噬水平明顯增強(qiáng)，

14、通過Real-timePCR、Westernblot、免疫熒光方法，檢測(cè)到脊髓損傷后1h始其自噬水平開始上升，2h達(dá)到高峰。
　　第二部分丙戊酸抑制了大鼠脊髓損傷后脊髓組織自噬的表達(dá)并促進(jìn)了其功能的康復(fù)
　　研究目的
　　研究丙戊酸治療脊髓損傷后脊髓組織自噬水平的變化以及丙戊酸在神經(jīng)保護(hù)及功能康復(fù)中的作用。
　　研究方法
　　1丙戊酸治療
　　脊髓損傷后兩組動(dòng)物隨機(jī)配對(duì)給藥和生理鹽水，脊髓損傷后立即給

15、予腹腔注射丙戊酸，300mg/kg，Bid。對(duì)照組及假手術(shù)組給予等量的生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。給藥周期為2周。
　　2丙戊酸治療脊髓損傷后LC3及Beclin-1的蛋白及mRNA水平的測(cè)定
　　脊髓損傷后2h，通過Westernblot及Real-timePCR法檢測(cè)脊髓組織LC3及Beclin-1的蛋白及mRNA水平的變化。
　　3丙戊酸對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的測(cè)定
　　3.1通過LuxolFastblue對(duì)

16、髓鞘進(jìn)行染色
　　將切片置入95%酒精中5min，0.1%LuxolFastblue（LFB）溶液中57℃過夜。95%乙醇溶液洗去過多的染液，雙蒸水浸洗后，切片置入0.05%的碳酸鋰和70%的酒精中反復(fù)分化幾次，直到灰質(zhì)和白質(zhì)分界清楚。評(píng)估了跨度4mm的包含損傷中心的9個(gè)切片，在顯微鏡下對(duì)其照相×40倍，并用ImageJ1.44p軟件定量分析脊髓白質(zhì)中LFB陽性面積，計(jì)算損傷組織切片中LFB陽性面積與正常組織切片總面積的比率。

17、r>　　3.2通過尼氏染色對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行染色
　　收集包含損傷中心在內(nèi)的9張切冰凍片，切片放入1:1酒精/氯仿中過夜，然后放入95%酒精中及雙蒸水中浸洗，0.1%焦油紫溶液中37℃10min進(jìn)行染色。然后對(duì)切片雙蒸水浸洗，95%酒精中分化1min，脫水，透明，封片。奧林巴斯顯微鏡下對(duì)切片照相并對(duì)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)面積為從橫切面的一側(cè)經(jīng)中央管向另一側(cè)畫一水平線，對(duì)軀體同側(cè)的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元予以計(jì)數(shù)，并通過I

18、mageJ1.44p軟件進(jìn)行人工定量。
　　4.丙戊酸對(duì)脊髓損傷大鼠行為學(xué)影響的評(píng)定
　　術(shù)后每周行BBB評(píng)分，共6周。為保證評(píng)分的準(zhǔn)確性，由3位非實(shí)驗(yàn)人員了解評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)后，各自評(píng)分，取平均值。
　　5.統(tǒng)計(jì)處理
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。使用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。*P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<

19、br>　　結(jié)果
　　1丙戊酸促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)及功能的康復(fù)
　　1.1丙戊酸減少了大鼠脊髓損傷后脊髓髓鞘的損害
　　脊髓損傷后42天，應(yīng)用LFB染色評(píng)估髓鞘存活情況。與損傷組相比，丙戊酸治療組脫髓鞘的面積明顯的減少了。損傷組和丙戊酸組脊髓組織橫切面的總面積都比正常組的總面積小，但是丙戊酸組存活的髓鞘明顯多于損傷組。通過定量分析，在距離損傷中心1mm處的頭側(cè)，丙戊酸組（30.96%±0.58%）存活的髓鞘面積明顯大于損傷組（1

20、9.67±0.83%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*p<0.05)。(見圖7)
　　1.2丙戊酸增加了大鼠脊髓損傷后脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量
　　脊髓損傷后42天，應(yīng)用尼氏染色法對(duì)脊髓組織冰凍切片進(jìn)行染色，并計(jì)算脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)目。與損傷組相比，丙戊酸組脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元明顯增多。尤其是在距損傷中心上、下2mm處，其軀體同側(cè)脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p<0.5）(見圖8)
　　1.3丙戊酸促進(jìn)