丙戊酸鈉參與脊髓水平疼痛-瘙癢調(diào)控的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　基于疼痛(pain)抑制瘙癢(itch)，疼痛的緩解加重瘙癢的基本認(rèn)識(shí)，以及既往研究已經(jīng)證實(shí)組蛋白酶去乙酰化酶抑制劑(HDACi)通過(guò)表觀遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制抑制脊髓水平組蛋白去乙?；福℉DAC）的表達(dá)能夠減輕神經(jīng)病理性疼痛(NP)，初步探討組蛋白去乙?；敢种苿┍焖徕c(VPA)參與脊髓水平疼痛-瘙癢的調(diào)控。
　　方法：
　　第一階段：探索與疼痛、瘙癢相關(guān)的HDAC，成年KM雄性小鼠，20-25g，隨機(jī)分為對(duì)照

2、組（Con）、坐骨神經(jīng)高選結(jié)扎切斷組（SNI），瘙癢組（CQ），每組10只。造模成功后，處死小鼠，取小鼠腰膨大部位，提取總RNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。第二階段：考察丙戊酸鈉對(duì)小鼠神經(jīng)病理性疼痛的影響，成年KM雄性小鼠，20-25g，根據(jù)VPA劑量（5mg/kg、1mg/kg、0.2mg/kg）隨機(jī)分為空白對(duì)照組（Con組）、神經(jīng)病理性疼痛組（SNI組）、假手術(shù)組（Sham組）、神經(jīng)病理性疼痛+鞘內(nèi)注射5mg/kg丙戊酸鈉組（SNI+V

3、PA5mg/kg組或SV5組）、神經(jīng)病理性疼痛+鞘內(nèi)注射1mg/kg丙戊酸鈉組（SNI+VPA1mg/kg組或SV1組）、神經(jīng)病理性疼痛+鞘內(nèi)注射0.2mg/kg丙戊酸鈉組（SNI+VPA0.2mg/kg組或SV0.2組）、神經(jīng)病理性疼痛+鞘內(nèi)注射丙戊酸鈉溶媒組（SNI+NS組或SN組），每組8只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境5日后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，手術(shù)前1日測(cè)定每組小鼠基礎(chǔ)機(jī)械縮足閾值（MWT），手術(shù)后第5，6，7，8，9日連續(xù)鞘內(nèi)注射相應(yīng)劑量的VP

4、A及VPA溶媒，每日2次，注射時(shí)間為早晚八時(shí)，同時(shí)測(cè)定術(shù)后1，3，5，7，9，10日各組小鼠機(jī)械縮足閾值，測(cè)定閾值如與注射藥物同在一日時(shí)應(yīng)在當(dāng)日8點(diǎn)前測(cè)定MWT。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取腰膨大部位，進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn),比較相關(guān)HDAC表達(dá)情況。第三階段：考察神經(jīng)病病理性疼痛對(duì)氯喹誘導(dǎo)的急性瘙癢行為學(xué)的影響，成年KM雄性小鼠，20-25g，隨機(jī)分為神經(jīng)病理性疼痛+足底皮內(nèi)注射氯喹組（SNI+CQ組或SQ組）、神經(jīng)病理性疼痛+足底皮內(nèi)注射氯喹

5、溶媒組（SNI+v組或Sv組）、正常小鼠+足底皮內(nèi)注射氯喹組（Con+CQ組或CQ組）、正常小鼠+足底皮內(nèi)注射氯喹溶媒組（Con+v組或Cv組）,每組8只。SQ組和Sv組于術(shù)前1日測(cè)定基礎(chǔ)機(jī)械縮足閾值，于術(shù)后第1，3，5，7，9，10日連續(xù)測(cè)定機(jī)械縮足閾值，并于SNI術(shù)后第10日各組小鼠按實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)計(jì)分別足底皮內(nèi)注射氯喹或氯喹溶媒，分別視頻記錄各組小鼠足底皮內(nèi)注射CQ或CQ溶媒后30分鐘內(nèi)小鼠舔足時(shí)間。第四階段：探討丙戊酸鈉對(duì)疼痛-瘙癢

6、行為學(xué)的影響，成年KM雄性小鼠，20-25g，根據(jù)VPA劑量（5mg，1mg，0.2mg）隨機(jī)分為神經(jīng)病理性疼痛+鞘內(nèi)注射VPA5mg/kg+足底皮內(nèi)注射CQ組（SNI+VPA5kg/mg+CQ組或SV5Q組）、神經(jīng)病理性疼痛+鞘內(nèi)注射VPA1mg/kg+足底皮內(nèi)注射CQ組（SNI+VPA1mg/kg+CQ組或SV1Q組）、神經(jīng)病理性疼痛+鞘內(nèi)注射VPA0.2mg/kg+足底皮內(nèi)注射CQ組（SNI+VPA0.2mg/kg+CQ組或SV0

7、.2Q組）、神經(jīng)病理性疼痛+鞘內(nèi)注射VPA溶媒+足底皮內(nèi)注射CQ組、正常小鼠+鞘內(nèi)注射VPA5mg/kg+足底皮內(nèi)注射CQ組（Con+VPA5mg/kg+CQ組或CV5Q組）、正常小鼠+鞘內(nèi)注射VPA1mg/kg+足底皮內(nèi)注射CQ組（Con+VPA1mg/kg+CQ組或CV1Q組）、正常小鼠+鞘內(nèi)注射VPA0.2mg+足底皮內(nèi)注射CQ組（Con+VPA0.2mg/kg+CQ組或CV0.2Q組）、正常小鼠+鞘內(nèi)注射VPA溶媒+CQ組（Co

8、n+NS+CQ組或CNQ組），每組8只。所有組別操作時(shí)間點(diǎn)以SNI手術(shù)日為準(zhǔn)，以上各組小鼠按照規(guī)定劑量分別于SNI術(shù)后第5，6，7，8，9日連續(xù)鞘內(nèi)注射規(guī)定劑量的VPA或VPA溶媒，每日2次，注射時(shí)間為早晚八時(shí)，術(shù)后第10日各組小鼠足底皮內(nèi)注射CQ或CQ溶媒，并視頻記錄注射CQ或CQ溶媒后30分鐘內(nèi)小鼠舔足時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取腰膨大部位，進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn),比較相關(guān)HDAC表達(dá)情況。備注：以上所有操作SNI手術(shù)在小鼠左側(cè)后肢進(jìn)行

9、，足底皮內(nèi)注射CQ在小鼠右側(cè)足底進(jìn)行。
　　結(jié)果：
　　第一階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過(guò)計(jì)算熒光定量 PCR所得 Ct值，發(fā)現(xiàn) HDAC2的差異性表達(dá)與疼痛、瘙癢行為表型密切相關(guān)。第二階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果：疼痛行為學(xué)，SNI在術(shù)后1日 MWT開(kāi)始降低（P<0.01），第5日達(dá)到高峰，SNI組 MWT較Con組及Sham組明顯降低（P<0.001），SV組機(jī)械縮足閾值從術(shù)后第6日開(kāi)始較SNI組明顯升高（術(shù)后第6日P<0.01，第7-10日P<0

10、.001），并且表現(xiàn)出VPA的劑量依賴性（SV5組和SV0.2組均和SV1組比較，術(shù)后第6日，P<0.01,第7-10日，P<0.001），Con組與 Sham組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SN組與 SNI組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HDAC2表達(dá)在 SV5組最少，SV1組次之，SV0.2最多。第三階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果：瘙癢行為學(xué)：CQ組舔足時(shí)間比 Cv組舔足時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.001)，SQ組舔足時(shí)間較 Sv組顯著延長(zhǎng)（P<0.001），SQ組舔足時(shí)間比

11、CQ組舔足時(shí)間明顯縮短（P<0.001），Sv組舔足時(shí)間與 Cv組舔足時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第四階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SNI小鼠根據(jù)VPA劑量不同舔足時(shí)間表現(xiàn)出顯著差異性，SV5Q組舔足時(shí)間最長(zhǎng)，SV1Q組次之，SV0.2Q組最短（SV5Q組和SV0.2Q組與 SV1Q組比較，P<0.001），但較 SVQ組舔足時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P<0.001），SVQ組舔足時(shí)間與第二階段實(shí)驗(yàn) SQ組舔足時(shí)間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，正常小鼠根據(jù) VPA劑量不同舔足時(shí)間亦有明

12、顯差別，CV5Q舔足時(shí)間最長(zhǎng)，CV1Q次之，CV0.2Q最短（CV5Q和CV0.2Q與 CV1Q比較，P<0.001）,但較 CVQ組舔足時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P<0.001），CVQ組舔足時(shí)間與第二階段實(shí)驗(yàn) CQ組舔足時(shí)間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意思。同時(shí)相同劑量的兩組小鼠間舔足時(shí)間比較亦有顯著性差（CV5Q與 SV5Q，CV1Q與SV1Q，CV0.2Q與SV0.2Q，P<0.001）。在正常及SNI小鼠中，HDAC2的表達(dá)隨VPA劑量增加而減少，且各組