自噬在甲基汞致星形膠質細胞損傷中的作用研究.pdf

1、目的:甲基汞是一種全球性環(huán)境污染物，是無機汞通過微生物和植物的生物轉化而生成，人體的主要暴露途徑為食用被甲基汞污染的魚貝類和稻米。甲基汞對人體各組織系統如神經系統、生殖系統、免疫系統等都會產生損害，其最主要靶器官為神經系統，因其脂溶性大，因而可以穿過血腦屏障和胎盤，會造成中樞神經系統不可逆的損傷，影響胎兒的正常發(fā)育。目前，甲基汞的毒性機制尚不明確。因此，本實驗以原代大鼠星形膠質細胞為研究對象，探索:1.甲基汞對星形膠質細胞的毒性;2.自

2、噬在甲基汞致星形膠質細胞損傷中的作用;3.甲基汞誘導星形膠質細胞的凋亡情況;4.利用抗氧化劑預處理探討甲基汞可能的毒性機理。最終為明確甲基汞致毒機制，為甲基汞中毒的預防與治療提供理論基礎。
　　方法:1.甲基汞處理原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質細胞，通過MTT法檢測甲基汞對星形膠質細胞活力的影響，LDH漏出率檢測甲基汞的細胞毒性，研究不同濃度(0、1、2、5、10μmol/L)以及不同處理時間(0、3、6、12、24 hrs)，甲基汞對星

3、形膠質細胞的影響。2.甲基汞（5μmol/L，6hrs）處理星形膠質細胞，經吖啶橙(AO)染色與蛋白免疫印跡實驗檢測酸性囊泡的形成以及自噬相關蛋白表達，確定細胞自噬的發(fā)生。3.不同濃度甲基汞（0、1、5、10μmol/L）處理星形膠質細胞6小時，用Annixin V FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測甲基汞誘導的星形膠質細胞凋亡率。4.不同濃度甲基汞(0、1、5、10μmol/L)處理星形膠質細胞6小時，然后采取蛋白印跡法檢測甲基汞處

4、理星形膠質細胞細胞中自噬與凋亡相關蛋白表達的劑量-效應關系。5.采用雷帕霉素（rapamycin）誘導細胞自噬和3-甲基腺嘌呤(3-MA)，氯喹(CQ)，Atg5 siRNA基因干擾抑制細胞自噬等實驗手段調節(jié)細胞自噬水平，隨后用MTT法與蛋白印跡法觀察調節(jié)自噬對甲基汞致星形膠質細胞毒性的影響以及自噬、凋亡相關蛋白表達情況，以及Annixin V FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡，評價自噬的調控對甲基汞誘導的細胞凋亡的影響。6

5、.利用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理(5mmol/L，4hrs)，MTT法檢測甲基汞處理下星形膠質細胞細胞活力的變化來研究抗氧化劑對甲基汞毒性及甲基汞誘導自噬的影響，探討甲基汞可能的作用機制。
　　結果:1.甲基汞對星形膠質細胞具有細胞毒性，并且呈濃度時間依賴性;2.吖啶橙(AO)染色，蛋白免疫印跡與Annixin V FITC/PI細胞凋亡試劑盒檢測結果顯示甲基汞處理星形膠質細胞會顯著地誘導細胞自噬與細胞凋亡的發(fā)生(P

6、＜0.05)，并且隨著甲基汞處理濃度的升高，星形膠質細胞細胞凋亡比例也隨之上升，具有濃度依賴關系;3.蛋白印跡分析結果顯示不同濃度甲基汞處理下，自噬標志性蛋白LC3II的轉換，Beclin1，P62/SQSTM1的蛋白水平顯著上升(P＜0.05)，并且隨著甲基汞濃度的增大，呈現先上升后下降的趨勢;4.用自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)，氯喹(CQ)及Atg5 siRNA基因干擾預處理細胞后，細胞自噬標志性蛋白表達降低，差異具有

7、統計學意義(P＜0.05)，且抑制細胞自噬可增強甲基汞的細胞毒性;5.自噬誘導劑雷帕霉素（rapamycin）預處理則顯著地增強細胞自噬標志蛋白的表達(P＜0.05)，減輕甲基汞的細胞毒性;6.N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理減弱甲基汞誘導的星形膠質細胞細胞活力的降低并具有統計學意義(P＜0.05)，同時抑制甲基汞誘導的細胞自噬。
　　結論:甲基汞可誘導原代星形膠質細胞中自噬的發(fā)生，細胞自噬在甲基汞誘導的細胞毒性中的作用為應激性適