轉錄因子HOXC9在膠質母細胞瘤中的作用及其對細胞自噬的調控研究.pdf

1、膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是惡性程度高的膠質瘤，擁有很強的增殖、遷移和侵襲能力。約占全部顱內腫瘤的12～15%，由于腫瘤與正常的腦組織之間沒有特別明顯的邊界，手術方法也不能將其完全切除，又因其發(fā)生于顱腔中，常規(guī)的放療和化療對殘留的腫瘤細胞殺傷能力有限，所以膠質母細胞瘤病人的生存狀況一直得不到很好的改善，患者的平均壽命僅為15個月左右，只有5%的患者壽命能夠延續(xù)5年以上，多數患者仍然死于膠質母細胞瘤的復發(fā)。因此深入了

2、解膠質母細胞瘤發(fā)病及惡化的分子機制，推動其預防和治療手段的發(fā)展迫在眉睫。
　　轉錄因子HOXC9（Homeobox C9）是同源異形框（Homeobox，HOX）家族的成員之一，主要在胚胎發(fā)育及成體細胞分化過程中提供前后軸定位信息的作用。近年來有報道顯示HOXC9基因的表達異?？赡芘c一些腫瘤的形成有關，因此闡明其與腫瘤之間的關系可能為腫瘤的治療提供新的思路。而HOXC9基因與膠質母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展是否相關目前還沒有相關的報道。本項

3、目就此展開研究探討HOXC9對膠質母細胞瘤病人預后的影響，及其對膠質母細胞瘤增殖、成瘤、遷移、侵襲能力的影響，并對HOXC9調控膠質母細胞瘤細胞自噬的機制進行了深入的研究，為膠質母細胞瘤的治療提供新的生物學理論和分子基礎。本研究目前取得的研究成果如下：
　?。?）HOXC9對膠質母細胞瘤預后的影響及其表達分析
　　為了研究HOXC9在膠質母細胞瘤中擔任什么角色，它的表達量是否與膠質母細胞瘤病人的預后相關，我們首先通過利用R2

4、:Genomics Analysis and Visualization Platform平臺上的兩個數據庫對膠質瘤病人預后和HOXC9表達量之間的關系進行分析。結果表明，HOXC9的表達量與膠質瘤病人的預后密切相關。HOXC9表達量高，病人預后差，生存率低；HOXC9表達量低，病人預后好，生存率高。由此可見，HOXC9的表達量與膠質瘤病人的預后密切相關。
　　膠質瘤的預后與其臨床分級有關，分級越高，患者的預后越差。我們通過數據庫

5、提供的數據對不同分級膠質瘤中HOXC9的表達量進行分析，我們發(fā)現(xiàn)，膠質瘤中HOXC9的表達量要高于正常膠質細胞，這暗示著HOXC9可能參與膠質瘤的發(fā)生過程。此外，并且隨著膠質瘤分級的提高，HOXC9的表達量也隨之提高，二者存在正相關，這暗示著HOXC9可能參與膠質瘤的發(fā)展過程。我們還發(fā)現(xiàn)，在不同分級膠質瘤中HOXC9的表達量也與病人的預后密切相關。HOXC9表達量高，病人預后差，生存率低；HOXC9表達量低，病人預后好，生存率高。

6、>　　隨后，我們用免疫印跡四個膠質母細胞瘤細胞系中HOXC9蛋白的表達量做了檢測。檢測結果發(fā)現(xiàn)，HOXC9在四個膠質母細胞瘤細胞系中普遍表達。A172的惡性程度在四個細胞系中相對較低，沒有成瘤能力，而它的HOXC9蛋白的表達量在四個細胞系中也相對較低，這暗示著HOXC9的表達量與膠質母細胞瘤的惡性程度可能存在一定的相關性。此外，我們通過免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）和免疫印跡（Western Blot）

7、檢測膠質母細胞瘤臨床樣本及其癌旁組織中HOXC9的表達量。從結果我們可以看到，膠質母細胞瘤樣本中HOXC9的表達水平要明顯高于其癌旁組織，這說明HOXC9可能參與膠質母細胞瘤的發(fā)生過程。
　　（2）HOXC9對膠質母細胞瘤增殖、遷移侵襲能力的影響
　　為了研究下調HOXC9對膠質母細胞瘤增殖能力的影響，我們利用慢病毒介導的 RNAi技術在三個膠質母細胞瘤細胞系里干擾 HOXC9基因的表達。在下調HOXC9表達之后，我們從顯微

8、鏡觀察到三個膠質母細胞瘤細胞系實驗組的細胞數目要明顯少于對照組，我們通過血球計數板分別對兩組細胞的數量進行計數，統(tǒng)計結果也與上述類似。這暗示著下調HOXC9會影響膠質母細胞瘤細胞的增殖能力。此外，我們用MTT法和BrdU法比較對照組與實驗組的細胞增殖能力。MTT法檢測顯示三個膠質母細胞瘤細胞系的細胞的增殖能力都在下調HOXC9之后發(fā)生了明顯的下降。免疫熒光檢測及陽性信號統(tǒng)計顯示實驗組BrdU陽性細胞數目要明少于對照組，這說明實驗組在進行

9、DNA復制的細胞減少，這也從另一個角度說明實驗組細胞增殖能力減弱。
　　為了研究下調HOXC9對膠質母細胞瘤細胞遷移及侵襲能力有沒有影響，我們首先進行了細胞劃痕實驗。從兩個細胞系的實驗結果我們可以看出，HOXC9干擾組膠質母細胞瘤細胞的劃痕愈合能力要明顯弱于對照組，這說明HOXC9干擾組細胞的遷移能力被削弱。隨后，我們又進行了Transwell實驗。實驗結果表明，兩個膠質母細胞瘤細胞系HOXC9下調組在相同時間內穿膜的細胞數要明顯

10、少于對照組。這再次說明HOXC9在膠質母細胞瘤細胞遷移能力中發(fā)揮重要作用。為了檢測細胞的侵襲能力是否受到影響，我們進行了基質膠（Matrigel）Transwell實驗。實驗結果顯示，兩個膠質母細胞瘤細胞系下調HOXC9組穿過含有基質膠的Transwell小室的能力要明顯比對照組弱。這說明膠質母細胞瘤細胞的侵襲能力在下調HOXC9之后受到了抑制。
　　（3）HOXC9對膠質母細胞瘤自噬的影響及其調控機制
　　通過流式細胞儀和

11、Western Blot方法檢測我們發(fā)現(xiàn)，三個膠質母細胞瘤細胞系在干擾HOXC9之后并沒有發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。通過瞬時轉染，我們向細胞導入一個可以表達帶綠色熒光標簽GFP的LC3B蛋白的載體。從對三個膠質母細胞瘤細胞系的實驗中我們都觀察到，shHOXC9組細胞在發(fā)生自噬；而Control組細胞沒有發(fā)生自噬。通過細胞免疫熒光實驗和Western Blot檢測我們發(fā)現(xiàn)，下調HOXC9之后膠質母細胞瘤細胞的自噬增強了。
　　為了研究為何

12、在膠質母細胞瘤中下調HOXC9會引發(fā)細胞自噬，我們通過查閱相關文獻，篩選出8個候選可能參與調控自噬的基因。通過實時熒光定量PCR檢測我們發(fā)現(xiàn)，在下調HOXC9之后，DAPK1基因的mRNA表達量顯著升高。我們把DAPK1作為潛在的重要下游靶標又進一步在三個膠質母細胞瘤細胞系里面檢測他的蛋白表達，結果顯示，三個細胞系shHOXC9組DAPK1蛋白的表達水平明顯高于Control組。DAPK1只有在其第308位絲氨酸沒有被磷酸化時才能夠激活

13、細胞自噬，因此，我們通過Western Blot對兩個膠質母細胞瘤細胞系的pSer308-DAPK1進行了檢測，檢測結果顯示，在下調HOXC9之后pSer308-DAPK1的量并沒有增多，而DAPK1的總量發(fā)生了明顯的上升，這說明308位絲氨酸沒有被磷酸化的DAPK1蛋白量相對升高，也就是說能夠激活細胞自噬的DAPK1蛋白發(fā)生上調，從而增強細胞自噬。我們把皮下成瘤的樣本拿來檢測得到了類似的結果。接著，我們構建了DAPK1 shRNA慢病

14、毒載體，在三個膠質母細胞瘤細胞系中下調HOXC9誘導細胞自噬后下調DAPK1基因的表達。通過Western Blot檢測我們發(fā)現(xiàn)，三個細胞系下調DAPK1組細胞自噬明顯減弱。DAPK1誘導細胞自噬需要通過下游因子Beclin1介導，于是為了了解干擾HOXC9誘導的細胞自噬是否是通過DAPK1-Beclin1通路，我們構建了Beclin1 shRNA慢病毒載體。在兩種膠質母細胞瘤細胞系中干擾HOXC9誘導細胞自噬后，下調Beclin1的表

15、達，從實驗結果我們觀察到，下調Beclin1組比起對照組的自噬要明顯減弱。于是我們的實驗結果證明干擾HOXC9誘導的細胞自噬主要是通過激活DAPK1-Beclin1這條通路。
　　為了了解HOXC9是如何調控DAPK1基因的表達，我們首先對DAPK1的啟動子進行了分析。我們克隆了5個長度不同DAPK1啟動子片段并將其插入pGL3-Basic熒光素酶報告載體上，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)的檢測我們發(fā)現(xiàn)，-1121~-368這段序列可能擁

16、有能被某些轉錄抑制子結合的微點存在。HOXC9通常作為一個轉錄抑制因子調控基因表達，為了了解HOXC9是否是DAPK1的轉錄抑制子，我們進行了染色體免疫共沉淀實驗。通過ChIP實驗我們檢測到HOXC9在DAPK1啟動子-528～-412bp處有較高結合。有意思的是P2區(qū)域剛好落在-1121～-368之間，這暗示著HOXC9是通過結合到DAPK1啟動子-528～-412bp處抑制DAPK1基因的表達。過去曾有報道HOXC9可以特異的識別并

17、結合ATTTAT序列，通過對DAPK1轉錄起始位點上游-528～-412bp序列進行分析，我們發(fā)現(xiàn)了一段ATTTAT序列位于-442～-437之間。以上數據表明，HOXC9是通過結合到DAPK1轉錄起始位點上游-442～-437序列來抑制DAPK1基因的表達。
　?。?）HOXC9對膠質母細胞瘤細胞成瘤能力的影響
　　為了了解下調HOXC9是否對膠質母細胞瘤的克隆形成能力有影響，我們用兩種膠質母細胞瘤細胞系進行了體外的軟瓊脂

18、克隆形成實驗。從實驗結果我們觀察到，兩個膠質母細胞瘤細胞系shHOXC9組形成的克隆大小比Control組要小，而且形成克隆的數目也比對照組要少。這說明干擾HOXC9的表達影響膠質母細胞瘤的克隆形成能力。為了了解干擾HOXC9是否對膠質母細胞瘤的體內成瘤能力有影響，我們做了小鼠皮下成瘤實驗。我們用到兩種膠質母細胞瘤細胞系，注射于小鼠背部靠臀側，左側臀注射Control細胞，右側臀注射shHOXC9細胞。從實驗結果我們可以看到，干擾HOX