內皮-單核細胞激活多肽Ⅱ調控膠質瘤干細胞自噬的機制研究.pdf

1、目的：
　　腦膠質瘤是嚴重影響人類健康的疾病，其預后差、生存期短，盡管最近10年，惡性膠質瘤綜合治療領域取得了一系列進展，但患者2年生存率仍不足30％。腫瘤干細胞的發(fā)現(xiàn)促使我們重新審視惡性腫瘤的生物學行為。本研究旨在明確EMAP-Ⅱ是否通過自噬抑制GSCs的增殖及其可能的機制。
　　方法:
　　1、腦膠質瘤干細胞的提取和膠質瘤干細胞裸鼠皮下移植瘤模型的制備。
　　2、應用MTT實驗檢測給予EMAP-Ⅱ作用0.5h

2、，1h，3h，6h，不同作用濃度，0.005nM，0.05nM和0.5nM以及分別加入凋亡的抑制劑Z-VAD和自噬抑制劑3-MA后對GSCs增殖的影響。
　　3、應用流式細胞儀檢測給予EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h，6h以及3-MA預處理后GSCs細胞周期的變化。
　　4、應用流式細胞儀檢測給予EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h及6h后GSCs細胞凋亡的變化。
　　5、應用Transwell法檢測給予EMAP-

3、Ⅱ作用0.5h，1h及3h后GSCs細胞的轉移侵襲變化。
　　6、裸鼠皮下成瘤模型中，分別給予GSCs及EMAP-Ⅱ作用0.5h后的GSCs檢測皮下成瘤的體積差異。
　　7、應用Western blot法檢測給予EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h，6h以及3-MA預處理后，EMAP-Ⅱ作用0.5h，GSCs中LC3和P62的蛋白質表達水平變化。
　　8、用透射電鏡觀察正常GSCs和給予EMAP-Ⅱ作用0.5h，0.0

4、5nM后的GSCs。
　　9、應用免疫熒光法檢測給予EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h后，LC3和P62表達水平的變化。
　　10、應用Western blot法檢測給予EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h，6h以及3-MA預處理后，EMAP-Ⅱ作用0.5h，GSCs中p-PI3K，PI3K，p-AKT, AKT, p-mTOR以及mTOR蛋白質的表達水平變化。
　　11、應用Western blot法檢測給予PI3

5、K/AKT/mTOR通路激活劑IGF-1預處理后，EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h以及EMAP-Ⅱ與3-MA作用0.5h，GSCs中LC3，p-AKT, AKT, p-mTOR以及mTOR蛋白質的表達水平變化。
　　12、應用Western blot法檢測給予內質網應激通路抑制劑TUDC預處理后，EMAP-Ⅱ作用0.5h以及EMAP-Ⅱ與TUDC作用0.5h，GSCs中GRP78，eIF2α，CHOP蛋白質的表達水平變化。

6、r>　　13、Western blot法檢測膠質瘤標本中TRAP1蛋白的表達水平變化。
　　14、免疫組化法檢測膠質瘤組織中TRAP1蛋白的表達。
　　15、所有數據以SPSS17.0軟件進行分析，TRAP1表達量與臨床病例特點相關分析采用Mann-Whitney檢驗和Kruskal-Wallis檢驗。生存分析數據應用未校正和校正的Cox回歸分析進行評價并繪制生存曲線。
　　結果:
　　1、成功分離、培養(yǎng)、鑒定了

7、腦膠質瘤干細胞，并建立了GSCs顱內和皮下移植瘤模型。
　　2、EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h，6h后，GSCs的增殖均受抑制，且在0.5h，濃度為0.05nM時抑制效果最為明顯。經3-MA預處理后，EMAP-Ⅱ的上述作用受到顯著的抑制，而Z-VAD處理無明顯作用。
　　3、EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h，6h后，GSCs的細胞周期阻滯于S期，且在0.5h時抑制效果最為明顯。經3-MA預處理后，EMAP-Ⅱ的上述

8、作用受到顯著的抑制。
　　4、EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h，6h后，GSCs的細胞凋亡無明顯變化。
　　5、EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h后，GSCs細胞轉移侵襲均受到抑制，在0.5h時抑制最為明顯。
　　6、在裸鼠模型中，EMAP-Ⅱ處理后的GSCs成瘤體積明顯小于正常GSCs。
　　7、EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平明顯上升，P62表達水平明顯下降，EMAP

9、-Ⅱ作用0.5h時變化最為顯著，隨后逐漸減弱，6h恢復到未用藥水平。3-MA處理后無明顯變化。
　　8、EMAP-Ⅱ作用0.5h，0.05nM后GSCs中出現(xiàn)較多的自噬小體。
　　9、EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h后LC3表達水平明顯上升，P62表達水平明顯下降，EMAP-Ⅱ作用0.5h時變化最為顯著，隨后逐漸減弱。
　　10、EMAP-Ⅱ作用0.5h，1h，3h后，p-PI3K， p-AKT以及p-mTOR蛋白

10、的表達水平明顯下降，而PI3K，AKT以及mTOR的表達水平無明顯變化，在應用3-MA預處理后，與正常組相比p-PI3K， p-AKT以及p-mTOR蛋白的表達水平無明顯變化。
　　11、給予PI3K/AKT/mTOR通路激活劑IGF-1預處理后，EMAP-Ⅱ作用0.5h和1h所致的LC3，p-AKT以及p-mTOR蛋白表達的變化受到顯著抑制。
　　12、EMAP-Ⅱ作用0.5h，GRP78，eIF2α，CHOP蛋白表達均上

11、升。給予ER stress通路抑制劑TUDC預處理后，上述蛋白的變化受到顯著抑制。
　　13、TRAP1定位于76kDa，并且高級別膠質瘤標本TRAP1含量明顯高于低級別膠質瘤標本。
　　14、在全部的236例標本中，45例為強陽性，88例為中等陽性，71例為弱陽性，32例為陰性。在不同級別的膠質瘤中，TRAP1陽性率隨著病理級別的提高而增加。
　　15、TRAP1陽性率與KPS相關，與KPS＞80的患者相比，KPS＜

12、80的患者TRAP1陽性率更高。在整個隨訪過程中，236例患者有137例死亡。TRAP1表達強的膠質瘤患者更傾向于較差的預后。
　　結論:
　　1、EMAP-Ⅱ可以通過誘導GSCs發(fā)生自噬抑制其增殖。
　　2、EMAP-Ⅱ通過抑制PⅡ3K/AKT/mTOR通路誘導GSCs自噬。
　　3、EMAP-Ⅱ誘導GSCs自噬過程中，激活了PERK/eIF2α/CHOP通路介導的內質網應激。
　　4、TRAP1表達與膠