自噬相關(guān)基因Beclin 1表達(dá)對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約占全部腦腫瘤的45～55％。目前，腦膠質(zhì)瘤的治療手段主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療和綜合治療等，盡管近年來(lái)上述治療措施已取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但由于膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與周圍腦組織無(wú)明顯分界且易于復(fù)發(fā)，且療效均不甚理想。新的治療手段如基因治療等雖有望成為治愈膠質(zhì)瘤的途徑之一，但是目前仍缺乏理想可靠的治療靶標(biāo)。因此尋找調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子靶標(biāo)，明確其在膠質(zhì)瘤發(fā)病過(guò)程中的病理機(jī)制，已

2、成為神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
　　 自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，Atg)調(diào)節(jié)的細(xì)胞自噬活性下降在腫瘤的形成中具有重要作用。Beclin1(Atg6)是重要的自噬調(diào)節(jié)基因，主要作用是通過(guò)與Vps34/PI3K形成復(fù)合物促進(jìn)自噬， Bcl-2能與Beclin1結(jié)合抑制自噬活性。因?yàn)锽eclin1與Bcl-2家族中抑制凋亡的蛋白結(jié)合，但不能與促凋亡蛋白結(jié)合，并且研究Beclin1的分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其具有

3、Bcl-2家族中促凋亡蛋白共有的BH3結(jié)構(gòu)，所以Beclin1可能參與凋亡的調(diào)節(jié)。Beclin1被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，其雜合性缺失是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的原因之一。Beclin1抑制腫瘤的作用可能是提高腫瘤細(xì)胞自噬活性。Yue等應(yīng)用Beclin1基因敲除小鼠的胚胎干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Beclin1完全缺失小鼠死于胚胎早期，Beclin1雜合性缺失小鼠雖然表型正常，但體內(nèi)細(xì)胞自噬活性降低，而且自發(fā)腫瘤發(fā)生率高。Liang等將Beclin1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MC

4、F-7細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn)自噬空泡的數(shù)量增加，癌細(xì)胞體外增殖能力及惡性表型下降，并且在裸鼠中腫瘤形成能力降低。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化療能引發(fā)細(xì)胞自噬性死亡，而在凋亡抑制細(xì)胞中自噬誘導(dǎo)劑可上調(diào)Beclin1具有治療作用。Beclin1抑制腫瘤不僅誘發(fā)細(xì)胞自噬性死亡，而且能停滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤壞死及炎癥擴(kuò)散，預(yù)防細(xì)胞基因組突變。Beclin1基因還和一些腫瘤相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通道關(guān)系密切，如PTEN通道和Rb信號(hào)傳導(dǎo)通道都與Bec

5、lin1不同程度相關(guān)。因此，探討B(tài)eclin1參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展以及惡變的分子病理機(jī)制，尤其是在細(xì)胞自噬和凋亡中的作用，有助于明確膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為及機(jī)理，有望為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的分子靶標(biāo)。
　　 本研究擬通過(guò)觀察Beclin1在不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的確切表達(dá)情況，并通過(guò)過(guò)表達(dá)和敲減Beclin1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)，研究Beclin1在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬尤其是凋亡方面的作用。實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分：

6、第一部分，觀察Beclin1在腦星形細(xì)胞腫瘤組織中的蛋白表達(dá)水平以及與病理級(jí)別的相關(guān)性；第二部分，觀察Beclin1在U251和U87腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的mRNA和蛋白表達(dá)水平及相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及構(gòu)建Beclin1蛋白表達(dá)抑制和過(guò)表達(dá)的U87細(xì)胞株和檢測(cè)相關(guān)蛋白的結(jié)合情況；第三部分，研究Beclin1在U87細(xì)胞自噬、凋亡和增殖中的作用。
　　 第一部分Beclin1在星形細(xì)胞腫瘤組織中的表達(dá)
　　 目的：本研究檢測(cè)自噬

7、相關(guān)基因Beclin1在星形細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)情況，探討其與星形細(xì)胞腫瘤病理和臨床表現(xiàn)的相關(guān)性及意義。
　　 方法：用免疫組化和(或)免疫印跡法檢測(cè)62例不同級(jí)別的星形細(xì)胞腫瘤Beclin1蛋白表達(dá)，并結(jié)合臨床和病理因素進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：免疫組化顯示Beclin1蛋白在星形細(xì)胞腫瘤胞質(zhì)中表達(dá)強(qiáng)弱隨腫瘤級(jí)別升高而降低，在胞核中則相反。免疫印跡法檢測(cè)高級(jí)別星形細(xì)胞腫瘤(Ⅲ/Ⅳ級(jí))Beclin1平均光密度比值小于低級(jí)別腫瘤

8、(Ⅰ/Ⅱ級(jí)，p=0.036)。LC3B-Ⅰ在不同級(jí)別的星形細(xì)胞腫瘤中表達(dá)無(wú)明顯差異，但LC3B-Ⅱ在膠母細(xì)胞瘤中的平均光密度比值低于其他級(jí)別的腫瘤(p=0.030)。Beclin1和LC3B-Ⅱ高表達(dá)者的生存率有升高趨勢(shì)，兩者在星形細(xì)胞腫瘤中表達(dá)正性相關(guān)(p=0.035)。
　　 結(jié)論：Beclin1和LC3B-Ⅱ在膠母細(xì)胞瘤中的表達(dá)下調(diào)，自噬活性的改變可能與星形細(xì)胞腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。
　　 第二部分Beclin1在

9、惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)
　　 目的：研究Beclin1、Bcl-2家族蛋白和Vps34在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87中的表達(dá)和蛋白之間的結(jié)合情況；研究Beclin1在U87細(xì)胞株經(jīng)過(guò)表達(dá)或RNA干擾后與Bcl-2家族蛋白和Vps34結(jié)合情況。
　　 方法：用脂質(zhì)體法將表達(dá)Beclin1siRNA和Beclin1基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞株，鑒定轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞Beclin1蛋白表達(dá)。應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)Be

10、clin1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87中的mRNA表達(dá)水平，應(yīng)用免疫印跡方法研究Beclin1、Bcl-2家族蛋白和Vps34在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平，應(yīng)用免疫共沉淀檢測(cè)Beclin1與Bcl-2家族蛋白和Vps34之間的結(jié)合情況。
　　 結(jié)果：Beclin1siRNA和Beclin1基因表達(dá)的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染進(jìn)入U(xiǎn)87細(xì)胞后抑制和過(guò)表達(dá)效果較好。RT-PCR和免疫印跡結(jié)果提示Beclin1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤細(xì)胞

11、系U251和U87中明顯下調(diào)。免疫印跡提示Bcl-2家族蛋白在U251和U87中明顯上調(diào)(P＜0.05)。Beclin1和Vps34復(fù)合物能在各處理組U87中發(fā)現(xiàn)；在各對(duì)照組和RNA干擾后的U87中檢測(cè)免疫共沉淀未發(fā)現(xiàn)Beclin1分別與Bcl-2、Bcl-xL形成復(fù)合物，而在過(guò)表達(dá)Beclin1的U87中檢測(cè)出Beclin1分別與Bcl-2、Bcl-xL形成復(fù)合物。
　　 結(jié)論：Beclin1在所有被檢測(cè)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，其m

12、RNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于正常膠質(zhì)細(xì)胞，且Bcl-2家族蛋白在U87細(xì)胞中表達(dá)增高。U87中Beclin1與Vps34能形成復(fù)合物，在Beclin1過(guò)表達(dá)時(shí)Beclin1才與Bcl-2類似蛋白形成復(fù)合物。不同處理組之間Beclin1蛋白結(jié)合變化可能是Beclin1參與調(diào)節(jié)自噬和凋亡作用的機(jī)制。
　　 第三部分Beclin1表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬、凋亡和增殖的作用
　　 目的：研究過(guò)表達(dá)或抑制Beclin1對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)

13、胞株自噬、凋亡和增殖的影響；以及Beclin1在凋亡通路中的具體作用。
　　 方法：利用第二部分中U87細(xì)胞株的不同處理組培養(yǎng)48小時(shí)，采用免疫印跡檢測(cè)LC3、p62在各組的表達(dá)；用Hoechst33258染色及流式細(xì)胞儀測(cè)定各組凋亡細(xì)胞比例；氚標(biāo)胸腺嘧啶脫氧核苷(trituum-labelled thymidine，3H-TdR)摻入檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率。用免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞色素C的分布和表達(dá)情況；用免疫印跡檢測(cè)活性

14、caspase3/8/9表達(dá)；用免疫熒光檢測(cè)Beclin1和caspase3在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：LC3-Ⅱ在過(guò)表達(dá)組呈高表達(dá)；在抑制組呈低表達(dá)。P62在過(guò)表達(dá)組呈低表達(dá)；抑制組呈高表達(dá)。Hoechst33258染色及流式細(xì)胞儀測(cè)定顯示過(guò)表達(dá)組凋亡細(xì)胞比例增高；其他各組無(wú)明顯變化。3H-TdR法顯示過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖減緩，其他各組無(wú)明顯變化。免疫熒光顯示過(guò)表達(dá)組細(xì)胞色素C彌散分布于細(xì)胞中；其他各組細(xì)胞色素C分布比較集中且僅

15、限于胞質(zhì)。免疫印跡發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組胞質(zhì)中細(xì)胞色素C有表達(dá)，其他各組未見(jiàn)明顯表達(dá)。免疫印跡檢測(cè)顯示過(guò)表達(dá)組活性caspase3/9表達(dá)增高，caspase8在各組間無(wú)明顯差別。免疫熒光顯示Beclin1和caspase3在過(guò)表達(dá)Beclin1的U87細(xì)胞中的表達(dá)增加，并有相關(guān)性。
　　 結(jié)論：在Beclin1抑制組中細(xì)胞自噬活性下降，凋亡活性無(wú)明顯變化，細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化。而過(guò)表達(dá)組自噬活性增強(qiáng)，凋亡活性增強(qiáng)，細(xì)胞增殖減緩。過(guò)表達(dá)組胞