shRNA抑制hif-1α及hTERT基因表達(dá)誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究shRNA抑制hif-lα、hTERT基因表達(dá)誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡，為腦膠質(zhì)瘤多基因治療提供理論依據(jù)。 方法：①取人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本制備單細(xì)胞懸液后，加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子EGF、bFGF和B27類似神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中克隆培養(yǎng)。待細(xì)胞懸浮形成腦腫瘤干細(xì)胞球時(shí)備用。②構(gòu)建能特異性作用于hif-1α mRNA、 hTERT mRNA的小發(fā)夾RNA(shRNA)質(zhì)粒表達(dá)載體，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的腫瘤干細(xì)胞，研究腦膠質(zhì)瘤

2、干細(xì)胞增殖和凋亡的影響。③隨機(jī)化分五組：干擾hif-1α、hTERT基因組(雙干擾組)，干擾hif-1α組，干擾hTERT組，空載體組，空白對(duì)照組。④各組均在干擾1,3,5,7天后收集細(xì)胞，MTT法檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞早期凋亡，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)hTERT基因和HIF-1 α基因的mRNA表達(dá)量，Western-blot檢測(cè)hTERT蛋白和HIF-1α蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：①M(fèi)TT法檢測(cè)結(jié)果顯示，

3、第5天雙干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于第1、3、7天(P<0.05)。第5天雙干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯高于HIF-1 α組、hTERT組、空載體組和空白對(duì)照組(P<0.05)；②細(xì)胞早期凋亡檢測(cè)顯示，第5天雙干擾組細(xì)胞凋亡率高于第1、3、7天(P<0.05)。第5天雙干擾組細(xì)胞凋亡率明顯高于HIF-1α組、hTERT組、空載體組和空白對(duì)照組(P<0.05)；⑨實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，雙干擾組抑制HIF-1 α、hTERT作用優(yōu)于空載體組和空白對(duì)照

4、組，并且第3天抑制HIF-1 α、hTERT蛋白作用明顯優(yōu)于第1、5、7天(P＜0.05)。雙干擾組、HIF-1 α組、hTERT組抑制HIF-1 α mRNA、hTERTmRNA作用無明顯差別(P>0.05)。④Western-blot蛋白檢測(cè)顯示雙干擾組抑制HIF-1 α、hTERT蛋白作用優(yōu)于空載體組和空白對(duì)照組，并且第3天抑制HIF-1 α、hTERT蛋白作用明顯優(yōu)于第1、5、7天(P<0.05)。雙干擾組、HIF-1 α組、h