膠質(zhì)瘤中RTVP-1的表達及RNA干擾抑制膠質(zhì)瘤細胞株RTVP-1基因的研究.pdf

1、目的：檢測RTVP-1在膠質(zhì)瘤中的表達；體外研究RNA干擾對人膠質(zhì)瘤u251細胞株、SHG-44細胞系RTVP-1基因的沉默，探討siRNA轉(zhuǎn)染時間、轉(zhuǎn)染濃度和目的基因表達之間的相關(guān)性；同時觀察沉默RTVP-1基因后，在不同轉(zhuǎn)染時間、轉(zhuǎn)染濃度，RNA干擾對細胞生長、細胞周期和細胞凋亡的影響。 方法：采用免疫化學法檢測膠質(zhì)瘤u251細胞株、SHG-44細胞系和臨床石蠟標本中RTVP-1蛋白的表達；脂質(zhì)體法將針對RTVP-1基因的s

2、iRNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤u251細胞株、SHG-44細胞系，運用半定量RT-PCR、Western-blot技術(shù)、流式細胞儀分別檢測不同轉(zhuǎn)染時間點以及不同轉(zhuǎn)染濃度細胞株目的mRNA、目的蛋白表達變化，以及細胞周期變化和凋亡情況；SRB法檢測細胞相對數(shù)量的變化。 結(jié)論： 一、RNA干擾沉默RTVP-1基因后，u251細胞生長明顯受抑制。SHG-44細胞生長沒有變化。 1.對u251細胞株，實驗所選擇的轉(zhuǎn)染片斷，在mRNA

3、水平對RTVP-1基因?qū)嵤┝顺聊?，沉默效率較高，是有效的沉默片斷。RT-PCR和Western-blot均未能檢測到SHG-44細胞系中RTVP-1的表達。 2.在u251細胞株中，在12、24、48、72小時四個時間點，對RTVP-1基因在mRNA水平達到最大沉默效應(yīng)是在轉(zhuǎn)染24小時，而引起蛋白表達的下降，則在轉(zhuǎn)染后48小時最明顯。 3.在u251細胞株中，在25nM、50nM、100nM、200nM濃度范圍內(nèi)，隨著s

4、iRNA濃度的增加，對目的基因的沉默效率隨之增高。低濃度siRNA即可抑制目的基因的表達，siRNA對目的基因的抑制與轉(zhuǎn)染濃度成正相關(guān)。Western-blot檢測目的蛋白的下降亦與轉(zhuǎn)染濃度成正相關(guān)。 二、RNA干擾沉默RTVP-1基因后使u251細胞阻滯在G1期，S期細胞減少，細胞凋亡增加，從而引起生長抑制。 三、免疫細胞化學和免疫組織化學提示SHG-44細胞系中RTVP-1不表達，u251細胞株和四個臨床膠質(zhì)瘤標本石