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文檔簡介
1、目的:檢測RTVP-1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá);體外研究RNA干擾對(duì)人膠質(zhì)瘤u251細(xì)胞株、SHG-44細(xì)胞系RTVP-1基因的沉默,探討siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染濃度和目的基因表達(dá)之間的相關(guān)性;同時(shí)觀察沉默RTVP-1基因后,在不同轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染濃度,RNA干擾對(duì)細(xì)胞生長、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。 方法:采用免疫化學(xué)法檢測膠質(zhì)瘤u251細(xì)胞株、SHG-44細(xì)胞系和臨床石蠟標(biāo)本中RTVP-1蛋白的表達(dá);脂質(zhì)體法將針對(duì)RTVP-1基因的s
2、iRNA轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤u251細(xì)胞株、SHG-44細(xì)胞系,運(yùn)用半定量RT-PCR、Western-blot技術(shù)、流式細(xì)胞儀分別檢測不同轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)以及不同轉(zhuǎn)染濃度細(xì)胞株目的mRNA、目的蛋白表達(dá)變化,以及細(xì)胞周期變化和凋亡情況;SRB法檢測細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的變化。 結(jié)論: 一、RNA干擾沉默RTVP-1基因后,u251細(xì)胞生長明顯受抑制。SHG-44細(xì)胞生長沒有變化。 1.對(duì)u251細(xì)胞株,實(shí)驗(yàn)所選擇的轉(zhuǎn)染片斷,在mRNA
3、水平對(duì)RTVP-1基因?qū)嵤┝顺聊聊瘦^高,是有效的沉默片斷。RT-PCR和Western-blot均未能檢測到SHG-44細(xì)胞系中RTVP-1的表達(dá)。 2.在u251細(xì)胞株中,在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn),對(duì)RTVP-1基因在mRNA水平達(dá)到最大沉默效應(yīng)是在轉(zhuǎn)染24小時(shí),而引起蛋白表達(dá)的下降,則在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)最明顯。 3.在u251細(xì)胞株中,在25nM、50nM、100nM、200nM濃度范圍內(nèi),隨著s
4、iRNA濃度的增加,對(duì)目的基因的沉默效率隨之增高。低濃度siRNA即可抑制目的基因的表達(dá),siRNA對(duì)目的基因的抑制與轉(zhuǎn)染濃度成正相關(guān)。Western-blot檢測目的蛋白的下降亦與轉(zhuǎn)染濃度成正相關(guān)。 二、RNA干擾沉默RTVP-1基因后使u251細(xì)胞阻滯在G1期,S期細(xì)胞減少,細(xì)胞凋亡增加,從而引起生長抑制。 三、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)提示SHG-44細(xì)胞系中RTVP-1不表達(dá),u251細(xì)胞株和四個(gè)臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本石
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