RNA干擾抑制膠質瘤U251細胞系EphB4基因表達及對細胞生長的影響.pdf

1、目的： 研究酪氨酸蛋白激酶受體EphB4基因在膠質瘤U251細胞中的表達及其功能特性，尋找診斷、治療膠質瘤的新方法和途徑，并為判斷惡性膠質瘤預后提供有用指標。 方法： 1、RT-PCR檢測U251細胞和U87細胞系中EphB4和EphA2基因的表達情況； 2、體外構建shRNA真核表達載體，進一步為體內試驗奠定基礎； 3、體外合成特異siRNA，采用脂質體轉染的方法導入膠質瘤U25l細胞系中，并觀

2、察和檢測其對U251細胞中EphB4基因表達的抑制情況；4、觀察特異siRNA轉入U251細胞后是否引起細胞增殖減慢及誘發(fā)細胞凋亡，以研究EphB4基因在膠質瘤的生長和侵襲轉移方面的作用機制；5、研究siRNA對裸鼠體內成瘤的影響。 結果： 1、通過基因水平檢測，EphB4和EphA2兩基因在U251和U87細胞中表達水平存在差異； 2、經測序鑒定及電泳證明已成功構建了針對EphB4基因的shRNA真核表達載體，

3、脂質體轉染細胞后可有效抑制EphB4基因表達； 3、經體外化學合成靶向EphB4基因的特異性siRNA，轉染U251細胞中，可有效抑制EphB4基因的mRNA表達水平，在實驗中轉染siRNA-EphB4 100nm/L，后，使EphB4mRNA的表達水平下降了75.0％； 4、抑制EphB4基因表達使腫瘤細胞的增殖能力減弱，使腫瘤細胞生長不同程度地阻滯于亞G1期，出現(xiàn)凋亡峰，并且細胞的遷移能力與對照組比較有所下降，tra

4、nswell小室穿膜細胞數(shù)與對照組比較有明顯差異； 5、成功建立裸鼠U251細胞皮下移植瘤模型，治療四周后siRNA組腫瘤體積較生理鹽水組縮小，病理學檢查siRNA組腫瘤細胞生長受到抑制，細胞散在稀疏。 結論： 1、EphB4和EpA2基因在U251細胞系中的表達水平明顯高于U87細胞系，提示兩種不同的細胞系可能在致瘤機制上存在差異，為研究腫瘤的發(fā)病機制提供一定的線索； 2、我們構建的shRNA真核表達載

5、體可特異抑制該基因的表達，達到類似基因敲除的效果，并且在長期穩(wěn)定表達載體的細胞系中，雙鏈RNA能夠長期發(fā)揮阻斷基因表達的作用； 3、應用RNA干擾技術可以有效抑制靶基因的表達，在轉染特異siRNA后出現(xiàn)腫瘤細胞的生長阻滯，誘導凋亡，表明EphB4基因在膠質瘤U251細胞的惡性進展與惡性侵襲轉移中發(fā)揮著關鍵性作用。結合我們以往的工作經驗可見RNA干擾作用可有效地應用于腫瘤的基因治療領域，并且為研究酪氨酸激酶Eph家族在膠質瘤的惡性