新印跡基因ARHI在人腦膠質(zhì)瘤中的表達、克隆及ARHI基因抑制膠質(zhì)瘤的實驗研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是人類最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，但對其發(fā)病機制尚不十分清楚，目前已認(rèn)識到，膠質(zhì)瘤是一種多基因異常疾病，和人體其他部位的腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展主要是原癌基因的激活與抑癌基因的失活并由此產(chǎn)生一系列基因異常和動態(tài)演進的結(jié)果。因此尋找與膠質(zhì)瘤發(fā)病相關(guān)的基因，深入探討膠質(zhì)瘤的分子病理機制，并在此基礎(chǔ)上開拓基因治療的新策略和靶點，成為膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的一項重要內(nèi)容。ARHI(aplysia ras homolog I)/NOEY2作為一個新發(fā)現(xiàn)

2、的抑癌基因，近年來研究表明，其在調(diào)控細胞的生長發(fā)育和凋亡，細胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移等過程中起著重要的作用，可能還有更重要的功能尚待人們挖掘。ARHI的發(fā)現(xiàn)，為ras家族在細胞中的正確定位提供了良好的解釋，為腫瘤的分子機理研究提供了新的思路，有望成為腫瘤基因治療的一種新的目的基因。ARHI基因在腫瘤中的研究是一個新的開端，迄今國內(nèi)外尚無有關(guān)于膠質(zhì)瘤中ARHI基因表達的文獻報道，亦無ARHI基因轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞的實驗研究報道。鑒于

3、以上原因，本實驗擬研究ARHI基因在膠質(zhì)瘤中的表達情況，通過惡性膠質(zhì)瘤細胞株U251，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達外源基因ARHI的膠質(zhì)瘤細胞系，并在此基礎(chǔ)上，觀察ARHI基因轉(zhuǎn)染對U251細胞體外生長的抑制作用并探討其可能機理，為膠質(zhì)瘤的基因診斷和治療提供新的思路和理論依據(jù)。 第一部分 ARHI基因在人正常腦組織、膠質(zhì)瘤標(biāo)本和膠質(zhì)瘤細胞系中的表達，及其與臨床病理的意義 目的：研究印跡基因ARHI(aplysia ras homol

4、og I)在人膠質(zhì)瘤中的表達情況及其與臨床病理的相關(guān)性，以初步探討ARHI在人膠質(zhì)瘤中表達的生物學(xué)意義。 方法：10例正常腦組織，59例新鮮膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，4種人膠質(zhì)瘤細胞系(U251，SHG44，BT325，U87MG)，采用RT-PCR和Westernblot法檢測ARHI基因mRNA和蛋白的表達。結(jié)合臨床病理資料對實驗結(jié)果統(tǒng)計分析，探尋ARHI基因在人膠質(zhì)瘤中表達的臨床意義。 結(jié)果：(1)RT-PCR顯示膠質(zhì)瘤組織

5、、細胞系中ARHI mRNA表達水平顯著低于正常腦組織，膠質(zhì)瘤組織中ARHI mRNA的表達水平隨腫瘤惡性程度增加而明顯降低，統(tǒng)計學(xué)分析顯示，低惡度膠質(zhì)瘤與高惡度膠質(zhì)瘤的表達水平有顯著差異(p<0.05)。(2)Western blot雜交檢測結(jié)果：膠質(zhì)瘤組織、細胞系中ARHI蛋白表達水平低于正常腦組織，膠質(zhì)瘤組織中ARHI蛋白的表達水平隨腫瘤惡性程度增加而明顯降低，低惡度膠質(zhì)瘤與高惡度膠質(zhì)瘤的表達水平有顯著差異(p<0.05)。(3)

6、ARHI的下調(diào)表達與膠質(zhì)瘤的臨床病理學(xué)分級成正相關(guān)，與膠質(zhì)瘤組織學(xué)類型以及患者的性別、年齡無關(guān)。 結(jié)論：ARHI特異性下調(diào)表達于膠質(zhì)瘤組織，可能是蛋白翻譯水平和(或)代謝水平改變的結(jié)果。ARHI基因可能參與了對膠質(zhì)瘤腫瘤細胞ras家族成員激酶活性的負反饋調(diào)節(jié)，其表達下降可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程有關(guān)。 第二部分 ARHI基因真核表達載體pcDNA3.1-ARHI的構(gòu)建 目的：應(yīng)用定向基因克隆技術(shù)，構(gòu)建ARHI基

7、因真核表達載體pcDNA3.1-ARHI，為下一步重組載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251細胞系奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)提取正常腦組織總RNA，根據(jù)人ARHI基因序列設(shè)計引物，應(yīng)用RT-PCR法擴增目的基因片斷。(2)目的基因和載體pcDNA3.1進行雙酶切，并通過定向克隆技術(shù)構(gòu)建ARHI基因真核表達載體pcDN.A3.1-ARHI。(3)通過雙酶切、基因序列測定分析對重組體pcDNA3.1-ARHI進行鑒定。 結(jié)果：(1)將質(zhì)粒pc

8、DNA3.1順利導(dǎo)入大腸桿菌DH5a內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率高。(2)酶切電泳結(jié)果顯示pcDNA3.1質(zhì)粒被EcoR I、Xho I成功雙酶切，酶切后質(zhì)粒位于Marker5.0kb稍后方。(3)將RT-PCR方法擴增的插入片段電泳，可見PCR擴增產(chǎn)物條帶位于marker700bp稍前方，與引物設(shè)計時預(yù)期擴增的690bp大小相吻合，證實擴增的片段即為目的片段。(4)重組質(zhì)粒酶切鑒定顯示690bp和5.4kb兩條預(yù)期目的條帶。(5)測序結(jié)果：重組體所含

9、DNA序列與Genebank公布ARHI序列(序列號：NM_004675)比較，未發(fā)現(xiàn)差異。 結(jié)論：應(yīng)用基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建ARHI基因真核表達載體pcDNA3.1-ARHI。 第三部分重組載體pcDNA3.1-ARHI轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細胞株U251 目的：建立并鑒定能穩(wěn)定表達外源ARHI基因的膠質(zhì)瘤細胞系以研究ARHI基因?qū)251細胞生物學(xué)行為的影響。 方法：將ARHI基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-

10、ARHI和空載體pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化細菌、擴增提取和純化后，應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞系U251。G418篩選陽性克隆并擴增培養(yǎng)傳代。Real Time Quantitative RT-PCR和Western blot法分別觀察分析U251細胞轉(zhuǎn)染前后目的基因ARHI在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達變化。 結(jié)果：重組體pcDNA3.1-ARHI轉(zhuǎn)染細胞株和空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細胞株均獲得氨芐青霉素

11、抗性。Real Time Quantitative RT-PCR、Western bolt雜交均顯示重組體pcDNA3.1-ARHI轉(zhuǎn)染細胞株中目的基因ARHI在mRNA和蛋白質(zhì)水平上表達均較空載體轉(zhuǎn)染細胞株和未轉(zhuǎn)染細胞株顯著增強(p<0.05)。 結(jié)論：成功構(gòu)建分別能穩(wěn)定表達外源性pcDNA3.1-ARHI、空載體pcDNA3.1的膠質(zhì)瘤細胞系。 第四部分 pcDNA3.1-ARHI重組載體轉(zhuǎn)染細胞的生物學(xué)效應(yīng)

12、 目的：研究外源基因ARHI轉(zhuǎn)染對膠質(zhì)瘤U251細胞體外生長的抑制作用及其可能機理。 方法：以成功構(gòu)建的分別能穩(wěn)定表達外源pcDNA3.1-ARHI、空載體pcDNA3.1的膠質(zhì)瘤細胞系和未轉(zhuǎn)染的U251細胞為研究對象，通過流式細胞儀分析、MTT比色、Tunel原位凋亡、劃痕修復(fù)、Transwell細胞侵襲等一系列細胞學(xué)功能實驗，觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株ARHI的表達差異對腫瘤細胞周期、細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。 結(jié)果