人腦膠質(zhì)瘤的增殖、凋亡與PTEN基因表達(dá)的關(guān)系研究.pdf

1、目的：膠質(zhì)瘤是惡性腫瘤中最難治的疾病之一，雖然采用了手術(shù)、放療、化療等綜合治療措施，患者的五年生存率仍然很低。細(xì)胞原癌基因的激活或抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移與基因的異常有著密切的關(guān)系，當(dāng)前的研究已證實(shí)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多步驟演變的復(fù)雜過(guò)程，因此，膠質(zhì)瘤本質(zhì)上是一種基因異常疾病。 PTEN作為新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因。本研究旨在探討抑癌基因

2、PTEN在人腦膠質(zhì)瘤組織中的基因和蛋白表達(dá)，并研究其表達(dá)與腫瘤惡性程度分級(jí)間的相關(guān)性，結(jié)合人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖凋亡情況，分析人腦膠質(zhì)瘤中PTEN基因的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響及二者之間的相關(guān)性，以進(jìn)一步明確PTEN基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義，為進(jìn)一步體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)以及腫瘤的防治提供理論依據(jù)。 方法：選取50例經(jīng)手術(shù)切除的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本，按WHO分級(jí)情況，分為高分化組與低分化組，以10例正常腦組織標(biāo)本為對(duì)照組。采用RT-PCR

3、方法，在轉(zhuǎn)錄水平，分析PTEN基因5、8、9三個(gè)外顯子水平mRNA的表達(dá)缺失情況。應(yīng)用免疫組化及WesternBlot方法檢測(cè)PTEN蛋白在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，比較膠質(zhì)瘤與正常腦組織中PTEN表達(dá)的差異，分析PTEN蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度之間的關(guān)系。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)膠質(zhì)瘤標(biāo)本和正常腦組織的增殖指數(shù)(PI)、S期細(xì)胞比率(SPF)、DNA倍性和凋亡指數(shù)(AI)以評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡

4、，分析膠質(zhì)瘤的PI、SPF、DNA倍性、AI與腫瘤病理級(jí)別的關(guān)系，以評(píng)價(jià)PTEN表達(dá)水平對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響及二者的相關(guān)性。 結(jié)果50例膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，外顯子1-8失表達(dá)例數(shù)為27例，表達(dá)例數(shù)為23例；外顯子1-9失表達(dá)例數(shù)為28例，表達(dá)例數(shù)22例；外顯子5-8失表達(dá)例數(shù)為27例，表達(dá)例數(shù)為23例；外顯子5-9失表達(dá)例數(shù)為26例，表達(dá)例數(shù)24例；在正常腦組織中無(wú)一例失表達(dá)。腦膠質(zhì)瘤不同基因片段與正常腦組織中mRNA的失表達(dá)情況存

5、在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；膠質(zhì)瘤不同基因片段間mRNA的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)學(xué)分析未見(jiàn)明顯差異，且與患者性別、年齡無(wú)關(guān)；但在不同臨床分期的腦膠質(zhì)瘤組織中，高分化組與低分化組腫瘤基因片段的PTENmRNA表達(dá)水平存在明顯差異，隨膠質(zhì)瘤惡性程度的升高，其失表達(dá)水平相應(yīng)升高。 免疫組化結(jié)果顯示：各級(jí)別腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織PTEN表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且PTEN蛋白隨膠質(zhì)瘤惡性分級(jí)的增高其表達(dá)減少；高分化組腫瘤和低分化組腫瘤間PTEN表達(dá)陽(yáng)性率有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義；Ⅱ級(jí)與Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)腫瘤間PTEN表達(dá)陽(yáng)性率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而Ⅲ級(jí)與Ⅳ級(jí)腫瘤之間PTEN表達(dá)陽(yáng)性率比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。 對(duì)50例膠質(zhì)瘤，10例正常腦組織共計(jì)60例樣本行PTEN蛋白濃度測(cè)定，得樣本的總蛋白濃度為2.89±0.76ug/ul，符合Westernblot測(cè)定的要求。Westernblot結(jié)果顯示在分子量45KD左右可以得到PTEN的雜交信號(hào)。在正常腦組織中PTEN的表達(dá)水平較高，隨膠質(zhì)瘤惡性程度的升高，P

7、TEN的蛋白表達(dá)水平相應(yīng)降低，Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中，PTEN表達(dá)水平最低；正常腦組織、不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤組織中均有45KD的雜交信號(hào)表達(dá)，而且各種組織之間的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。 對(duì)膠質(zhì)瘤樣本的流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示：50例膠質(zhì)瘤的PI為9.32﹪±4.41﹪，SPF為2.79﹪±2.43﹪。高惡性腫瘤(Ⅲ、Ⅳ級(jí))的PI(13.40﹪±5.91﹪)顯著高于Ⅰ級(jí)(8.62﹪±3.17﹪)，SPF雖然也增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。50例膠質(zhì)瘤中二

8、倍體34例，異倍體16例，未見(jiàn)四倍體，總的異倍體率為32.0﹪。其中低分化組(Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí))膠質(zhì)瘤的異倍體率為44.1﹪，高分化組膠質(zhì)瘤為6.3﹪。全部膠質(zhì)瘤的AI平均為7.88﹪±3.76﹪，Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤的AI(13.40﹪±5.91﹪)亦顯著高于Ⅱ級(jí)(9.08﹪±4.87﹪)，Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤間的AI、PI、SPF差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AI與PI、SPF存在弱的正相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論P(yáng)TEN基因的突變將導(dǎo)致其編碼蛋白的功能異常，但是并

9、不是所有的基因表達(dá)產(chǎn)物的異常與基因突變有關(guān)，基因在轉(zhuǎn)錄水平的異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中同樣起著重要的作用。人腦膠質(zhì)瘤中PTEN的表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤級(jí)別增高而降低，Ⅱ級(jí)與Ⅳ級(jí)腫瘤PTEN的表達(dá)率分別為83.3﹪和33.3﹪，PTEN陽(yáng)性表達(dá)水平可以用來(lái)對(duì)膠質(zhì)瘤的惡性程度進(jìn)行判斷。隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別升高腫瘤細(xì)胞的增殖活性亦隨之增高，膠質(zhì)瘤的PI可反映其病理級(jí)別，而與組織亞型無(wú)關(guān)；PI和SPF都是反映細(xì)胞增殖活性的客觀指標(biāo)，PI可能較SPF能