人腦膠質(zhì)瘤CD105表達(dá)和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞在血管生成中的作用及機(jī)制初探.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤是最常見和最具侵襲性的原發(fā)腦腫瘤。部位的特殊性導(dǎo)致手術(shù)柱柱難以徹底切除,血腦屏障的存在使化療和放療的效果也多不理想。因此，術(shù)后復(fù)發(fā)率高、生存期短、預(yù)后差。實(shí)體腫瘤的生長和侵襲與血管生成密切相關(guān)，新生血管的形成是促進(jìn)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。其中，膠質(zhì)瘤是人體血管化程度最高的腫瘤之一?？寡苌芍委熅哂懈咝?、特異性、不易產(chǎn)生耐藥和毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),并可避免血腦屏障對傳統(tǒng)治療藥物的影響,有望為腦腫瘤的治療提供一種新的更

2、有效方法?？寡苌蓙碇委熌[瘤在最近40年取得飛快進(jìn)展，部分藥物己經(jīng)進(jìn)入臨床前期研究和應(yīng)用于部分癌癥患者治療。然而目前使用的抗血管生成藥物臨床療效有限，而且不同腫瘤患者效果也不一致，這是當(dāng)前抗血管生成治療腫瘤所面臨的巨大挑戰(zhàn)。腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞所處腫瘤微環(huán)境可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞基因型的改變，導(dǎo)致抗血管生成靶點(diǎn)改變和產(chǎn)生抗性。另外，長期抗VEGF藥物的作用，會(huì)增加局部缺氧導(dǎo)致其他促血管生成因于如FGF-2等的分泌，這可能促進(jìn)腫瘤重新生長和轉(zhuǎn)

3、移。因此，除了需要聯(lián)合用藥外，抗血管生成藥物靶點(diǎn)的特異性是影響治療效果和減少副作用的關(guān)鍵。
　　目前認(rèn)為直接靶向增殖的內(nèi)皮細(xì)胞來抑制腫瘤血管生成是最有效和最有前途的治療策略。因此，尋找腫瘤血管特異的標(biāo)記物是抗血管生成治療腫瘤的重要研究內(nèi)容。近年愈來愈多證據(jù)表明，CD105(Endoglin)在腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞特異高表達(dá)，與腫瘤血管生成有關(guān)，有可能成為抗血管生成治療腫瘤重要的新靶標(biāo)。CD105編碼基因位于人染色體9q34，其編碼

4、的蛋白是一種同型二聚體的膜結(jié)合性糖蛋白，分于量為180kD，存在于細(xì)胞膜表面。CD105是TGF_β的受體復(fù)合物成分，參與了心血管發(fā)育、機(jī)體穩(wěn)態(tài)等生理過程。對CD105的生物學(xué)功能研究主要集中在作為TGF-β受體復(fù)合物，參與調(diào)節(jié)在生理、病理?xiàng)l件下細(xì)胞對TGF-β的反應(yīng)。近年發(fā)現(xiàn)，CD105是多種腫瘤新生血管內(nèi)皮的標(biāo)記物，而且和腫瘤分級、分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，可成為抗血管生成治療腫瘤的新靶標(biāo)。目前CD105在膠質(zhì)瘤血管生成中的作用及其機(jī)制

5、還未完全闡明。
　　最近，腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)或腫瘤始動(dòng)細(xì)胞(tumor initiating cells)在腫瘤血管生成中的重要作用越來越受到重視。CSCs是腫瘤中具自我更新、多向分化能力的少量細(xì)胞群體，有證據(jù)表明它們可能間接或直接參與了腫瘤血管新生化過程。這將促使人們重新認(rèn)識(shí)腫瘤的血管生成機(jī)制，給經(jīng)典的抗血管治療腫瘤策略帶來沖擊和挑戰(zhàn)。
　　本實(shí)驗(yàn)利用人體臨床病理標(biāo)本，研究了膠質(zhì)瘤組

6、織中CD105蛋白表達(dá)與病理學(xué)分級、臨床預(yù)后的關(guān)系；以新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本為材料，建立了膠質(zhì)瘤源性微血管內(nèi)皮細(xì)胞(glioma derived microvascular endothelial cells，GDMECs)和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells,GSCs)的培養(yǎng)方法并初步觀察其血管新生化表型；利用HUVE-12細(xì)胞為材料研究CD105基因在內(nèi)皮細(xì)胞血管生成中的作用。
　　獲得的主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　

7、1. CD105蛋白在不同膠質(zhì)瘤組織表達(dá)具有差異。CD105標(biāo)記的微血管密度(CD105-MVD)與膠質(zhì)瘤WHO分級有關(guān)，低級別(Ⅰ、Ⅱ級)與高級別(Ⅲ、Ⅳ)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P＜0.001)；高、低CD105-MVD值與患者的生存率顯著相關(guān)(Log Rank檢驗(yàn)：24.27；P＜0.001)?？勺鳛槟z質(zhì)瘤組織學(xué)分級及預(yù)測腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的指標(biāo)之一。
　　2.建立了有效的人膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系。所獲細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD

8、105,CD31,CD34,FⅧ-Rag鑒定為陽性；腫瘤細(xì)胞標(biāo)記GFAP和平滑肌、周細(xì)胞標(biāo)記α-SMA陰性;Matrigel三維培養(yǎng)具有內(nèi)皮細(xì)胞自發(fā)小管形成特性。
　　3.成功獲得膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球并連續(xù)傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)GSCs與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，GSCs具有誘導(dǎo)內(nèi)皮向球內(nèi)生長特性；經(jīng)內(nèi)皮培養(yǎng)基誘導(dǎo)后GSCs具有血管生成表型。
　　4.采用慢病毒干擾RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)現(xiàn)敲低內(nèi)皮細(xì)胞CD105基因可抑制其體外血管生成活性。通過流式細(xì)胞

9、術(shù)檢測、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法評價(jià)慢病毒干擾效果。病毒感染陽性細(xì)胞率流式細(xì)胞術(shù)檢測達(dá)到94％。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及免疫印跡法顯示shCD105組的CD105mRNA及蛋白水平顯著低于正常對照組和Mock組。shCD105與Mock組細(xì)胞相比，對VEGF促增殖反應(yīng)減弱，Transwell實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少(P＜0.01)；劃痕實(shí)驗(yàn)遷移速度變慢(P＜0.01)，Matrigel中小管形成數(shù)目明顯減少(P＜0.01)。實(shí)時(shí)熒光