人惡性膠質(zhì)瘤細胞和膠質(zhì)瘤干細胞功能性甲酰化肽受體（FPR）促血管生成作用.pdf

1、惡性實體瘤(malignant solid tumors)的生長和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤內(nèi)血管生成(angiogenesis)。因此，血管生成機制和抗血管生成一直是近些年腫瘤研究領(lǐng)域和前沿之一。人腦惡性膠質(zhì)瘤血管生成十分活躍，且微血管密度越高，患者預后越差。所以，以膠質(zhì)瘤為模型研究腫瘤血管生成機制和抗血管生成治療方法。 人們已經(jīng)認識到，瘤細胞通過分泌大量血管生成因子刺激內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管型形成而誘導腫瘤血管生成。在這一過程中血管內(nèi)皮

2、生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)和白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)是重要的促血管生成因子。越來越多的證據(jù)表明，G-蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體在腫瘤的生長和血管生成中具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，G-蛋白偶聯(lián)的甲?；氖荏w(formylpeptide receptor，F(xiàn)PR)與膠質(zhì)瘤級別和微血管密度密切相關(guān)，即它可能具有促進腫瘤生長和血管生成的功能。但其促血

3、管生成作用機制和治療學意義尚需探討。 近年發(fā)現(xiàn)，腫瘤中存在少量具有自我更新、多潛能和啟動與重建腫瘤組織表型能力的細胞，即腫瘤干細胞(tumor stem cells，TSCs)。這些干細胞是否參與血管生成缺乏研究。直到最近有報道，膠質(zhì)瘤干細胞在缺氧條件下可生成VEGF，提示其參與血管生成，但詳細機制不清。由于近年來有報道某些正常干細胞表達FPR，我們推測，腫瘤干細胞可能也表達FPR并介導血管生成。 為了進一步了解FPR在

4、膠質(zhì)瘤細胞生長和血管生成中的作用及其機制，我們分別對人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87及其中的CD133<'+>膠質(zhì)瘤干細胞表達的FPR在血管生成中的作用進行了研究，并對FPR是否可能成為膠質(zhì)瘤抗血管生成治療的新靶點進行探索。首先，我們檢測了人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87中FPR的表達及其活化后促細胞增殖和血管生成因子產(chǎn)生的作用，觀測我室自行合成的抗癌化合物諾帝(Nordy)對FPR所介導的上述效應的抑制作用；然后，我們對U87細胞中具有干細胞特性的細

5、胞進行分離、培養(yǎng)和鑒定；最后，我們研究了從U87細胞內(nèi)分離得到的具有干細胞特性的膠質(zhì)瘤干細胞及其表達的功能性FPR在血管生成中的作用。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1．人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87表達功能性FPR，活化后介導細胞增殖及VEGF和IL-8產(chǎn)生。采用免疫熒光染色法檢測U87、FPR-siRNA-U87(FPR基因的siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入U87細胞內(nèi)以干擾FPR在U87細胞的表達)和FPR-mock-U87細胞(將空質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染

6、入U87細胞)FPR的表達情況，結(jié)果顯示，U87和FPR-mock-U87細胞均表達FPR，而絕大多數(shù)FPR-siRNA-U87細胞不表達FPR，僅處于分裂期的細胞表達FPR。來用MTT、ELISA和RT-PCR法檢測人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87的FPR活化后的效應，結(jié)果顯示：①U87和FPR-mock-U87細胞的fMLF刺激組OD值均較對照組顯著升高，P<0.05；而FPR-siRNA-U87細胞的fMLF刺激組OD值在各時相點與對照組

7、相比無明顯差異(P>0.05)；②U87和FPR-mock-U87細胞fMLF刺激組VEGF、IL-8的mRNA水平和培養(yǎng)基上清中蛋白分泌量均較對照組顯著升高(P<0.05)；FPR-siRNA-U87細胞fMLF刺激組VEGF、IL-8的mRNA水平和培養(yǎng)基中蛋白分泌量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明，人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87表達功能性FPR，其活化后促進細胞增殖和血管生成因子VEGF和IL-8的產(chǎn)生和分泌。

8、 2．自行合成的抗癌化合物諾帝對U87細胞FPR表達和活化后效應具有抑制作用。①100μmol/L諾帝處理12h和24h后，U87細胞FPR平均吸光度值(AOD)分別為(582.4±173.46)和(478.852±107.43)，與對照組U87細胞(1332.1±275.26)相比有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，②以100μmol/L諾帝和100nmol/L fMLF處理24h后，與對照組相比，U87細胞透亮度和折光性降低，細胞活

9、力下降。MTT實驗結(jié)果顯示，諾帝對fMLF誘導的細胞增殖具有明顯的抑制作用；③ELISA檢測結(jié)果顯示，諾帝處理組U87細胞的VEGF、IL-8的mRNA水平和培養(yǎng)基上清中蛋白分泌量均較對照組顯著降低。上述結(jié)果表明，諾帝對人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87的FPR表達和該受體活化后的促瘤細胞增殖及血管生成因子VEGF和IL-8的分泌具有抑制作用。 3．人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87中存在具有增殖、自我更新和高成瘤能力的膠質(zhì)瘤干細胞。①免疫熒光染色

10、和流式檢測結(jié)果顯示，人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87中包含有CD133<'+>細胞，其比例為0.5％。②磁珠分選獲得的CD133<'+>細胞在干細胞培養(yǎng)基中可形成克隆性細胞球，CD133<'+>細胞形成的細胞球表達神經(jīng)干細胞的標志物nestin和CD133，不表達分化的星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP，而且CD133<'+>細胞球在含血清的常規(guī)培養(yǎng)中可分化為貼壁細胞，形態(tài)與親本U87細胞相似。③CD133<'+>細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力明顯強于CD13

11、3<'->細胞；且其增殖指數(shù)(PI％)顯著高于CD133-細胞移植瘤(P<0.05)；從形成的移植瘤組織中分離獲得的細胞經(jīng)流式細胞檢測，CD133<'+>細胞占5％，CD133<'+>細胞移植瘤組織高表達nestin和vimentin，低表達GFAP，而CD133<'->細胞移植瘤組織低表達nestin和vimentin，高表達GFAP。④采用體內(nèi)連續(xù)傳代法檢測顯示，CD133<'+>細胞移植瘤原代培養(yǎng)細胞形成的克隆性細胞球接種于裸鼠體

12、內(nèi)，可再次形成組織特征與CD133<'+>細胞移植瘤相似的腫瘤。上述結(jié)果表明，人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87中包含有具有體內(nèi)成瘤、無限增殖和自我更新能力的膠質(zhì)瘤干細胞。 4．膠質(zhì)瘤干細胞高表達FPR，活化后具有促血管生成作用。①免疫熒光染色顯示，CD133和G蛋白偶聯(lián)受體FPR共表達于CD133<'+>細胞形成的細胞球表面。②鈣流檢測結(jié)果顯示，在細胞外無鈣離子存在的條件下，10<'-4>～10<'-7>mmol/L fMLF與CD

13、133<'+>細胞G蛋白偶聯(lián)受體FPR結(jié)合，使細胞內(nèi)游離Ca<'2+>升高。fMLF誘導的CD133<'+>細胞熒光強度增強效應呈劑量依賴性，胞內(nèi)[Ca<'2+>]i流動包括一個上升過程、一個持續(xù)平臺期及一個緩慢下降期。③ELISA檢測顯示，膠質(zhì)瘤干細胞(CD133<'+>細胞)自身能夠分泌較多的VEGF。④將膜熒光染料CFSE標記的CD133<'+>細胞移植入裸鼠體內(nèi)后的結(jié)果顯示，裸鼠皮下移植瘤新生血管(CD105標記)多位于CFSE

14、標記的CD133<'+>膠質(zhì)瘤干細胞周圍；免疫組化染色顯示，移植瘤組織表達的VEGF及微血管密度(MVD)顯著高于CD133<'->細胞移植瘤。⑤ELIsA檢測顯示，10<'-4>～mmol/L fMLF可增加CD133<'+>細胞VEGF蛋白分泌，與對照組相比(無fMLF刺激)，具有顯著性統(tǒng)計差異(P<0.05)。上述結(jié)果表明，U87細胞中存在的膠質(zhì)瘤干細胞表達功能性。FPR，其活化后可促進VEGF的分泌，VEGF在膠質(zhì)瘤干細胞介導的

15、血管生成中具有重要作用。 綜上所述，(1)人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87表達的FPR被激活后，具有促進細胞增殖以及血管生成因子產(chǎn)生和分泌的功能，諾帝對U87細胞FPR表達和該受體活化后的促瘤細胞增殖及血管生成因子的產(chǎn)生和分泌具有抑制作用；(2)人惡性膠質(zhì)瘤細胞系U87細胞群體中存在少量具有增殖、自我更新和高成瘤能力的膠質(zhì)瘤干細胞，并首次發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細胞表達功能性FPR，活化后具有促血管生成作用。上述研究結(jié)果為惡性膠質(zhì)瘤抗血管生成治療提