肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2D促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞致瘤性機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腦腫瘤，約占所有腦腫瘤的50％以上，星形細(xì)胞瘤是最常見的腦膠質(zhì)瘤。研究發(fā)現(xiàn)MEF2D在惡性膠質(zhì)瘤組織及惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87MG、U251MG)中異常高表達(dá)，不斷有證據(jù)表明MEF2D表達(dá)可能是惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生和進(jìn)展中的關(guān)鍵因子。在這項(xiàng)研究中，我們?cè)噲D研究惡性膠質(zhì)瘤中MEF2D的功能和表達(dá)，通過研究MEF2D表達(dá)水平與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞致瘤性的相關(guān)性，進(jìn)一步闡明MEF2D在惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生

2、中的生物學(xué)功能，提供新的用于惡性膠質(zhì)瘤臨床預(yù)后參考的蛋白分子，為今后針對(duì)惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展制定新的治療策略提供新靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)
　　人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，U87MG(從含有GFAP陽性細(xì)胞惡性腦瘤衍生)和U251MG（從一個(gè)惡性膠質(zhì)瘤患者分類為Ⅳ級(jí)來源的），HeLa細(xì)胞（HeLa細(xì)胞用作MEF2D陽性對(duì)照）均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。初級(jí)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物根據(jù)前人方法所述取得。生長環(huán)境:

3、細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，10％胎牛血清，置于含有5％二氧化碳、37攝氏度的培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞在鏡下觀察的生長情況，判定細(xì)胞傳代時(shí)間，通常每1-2天將生長旺盛的U87MG、U251MG、HeLa、星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代。
　　2.原代培養(yǎng)/倫理聲明
　　本研究所采用的人腦惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本（腫瘤組織及癌旁正常組織）從成都軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除獲得，由成都軍區(qū)總醫(yī)院的倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)，并取得病人或親屬的書面知情同意。惡性膠質(zhì)瘤組織切

4、成小塊。機(jī)械操縱后獲得單細(xì)胞懸浮液。
　　對(duì)于原發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，樣品按照前人方法（具體見實(shí)驗(yàn)部分）的程序，由成都軍區(qū)總醫(yī)院的倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，取得孕婦的書面知情同意，從流產(chǎn)胎兒獲得。方法簡要地說，在除去腦膜后，從前囟腦組織切成片，用胰蛋白酶消化。將消化的細(xì)胞通過一個(gè)鋼網(wǎng)過濾并在補(bǔ)充有15％FBS中DMEM中培養(yǎng)，免疫熒光法檢測(cè)GFAP的表達(dá)。
　　3.免疫組化
　　免疫組織染色是關(guān)于使用鏈霉菌抗生物素-過氧化物

5、酶連接法，對(duì)手術(shù)獲取的惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本，進(jìn)行福爾馬林固定、石蠟包埋和組織切片。用MEF2D和Ki67抗體分別檢測(cè)MEF2D和Ki67的表達(dá)。蘇木素用于對(duì)細(xì)胞核染色。根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行凋亡實(shí)驗(yàn)。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)
　　根據(jù)RNA提取試劑盒的操作指南對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87MG、U251MG)提取總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照前人實(shí)驗(yàn)描述的方法進(jìn)行。簡要地說，第一鏈cDN

6、A合成和擴(kuò)增根據(jù)PrimeScriptTM RT試劑盒的操作進(jìn)行;實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)SYBR預(yù)混料前的Taq與Rotor-Gene的6000qRT-PCR系統(tǒng)的操作說明進(jìn)行。
　　5.病毒載體
　　慢病毒載體由王博士（病理科，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院）提供，其中包括Lv-GFP（過表達(dá)綠色熒光蛋白對(duì)照組），Lv-MEF2D（過表達(dá)MEF2D），Lv-shMEF2D-1、Lv-shMEF2D-2（不同程度下調(diào)MEF2D表達(dá)）和Lv-

7、Ctrl（陰性對(duì)照組）。
　　6.Western blot分析
　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品和免疫印記。簡言之，將細(xì)胞用裂解緩沖液在12，000rpm離心15min后，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒對(duì)組織或細(xì)胞蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行測(cè)定。然后通過SDS-PAGE在凝膠上分離總蛋白。
　　7.增殖試驗(yàn)
　　被不同慢病毒感染后的細(xì)胞以1000個(gè)每孔的濃度種植于96孔板中。MTS溶液(3-(4,5-diethylthiazol

8、-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium,inner salt，四氮唑藍(lán)鹽化合物）根據(jù)Promega推薦的方法來檢測(cè)細(xì)胞增殖率。
　　8.克隆形成實(shí)驗(yàn)
　　U87MG細(xì)胞用文中所示的慢病毒載體感染后，按照每個(gè)培養(yǎng)皿2000個(gè)細(xì)胞濃度接種在3.5cm的培養(yǎng)皿中。U251MG細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞用文中所示的慢病毒載體感染后，每孔100個(gè)細(xì)胞的

9、濃度接種于24孔板中。將細(xì)胞放置在37℃，在5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天。隨后將細(xì)胞用福爾馬林固定，用結(jié)晶紫染色。我們定義50個(gè)細(xì)胞作為一個(gè)克隆。
　　9.細(xì)胞周期檢測(cè)
　　通過流式細(xì)胞儀PI染色后如前人中描述的細(xì)胞周期流程操作。簡而言之，將細(xì)胞鋪于6孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞的濃度并用慢病毒處理。處理后48小時(shí)，收集細(xì)胞于240μl PBS和560μl的100％乙醇中，并在-20℃下固定過夜。細(xì)胞沉淀通過離心收集，并

10、再懸浮于含有20mM EDTA和1mg/ml RNA酶的500μl PBS中，然后在37℃下孵育1小時(shí)。PI溶液（50微克/毫升）的混合物用于樣品染色。然后將樣品進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，并在536nm的激發(fā)波長和617nm的發(fā)射波長進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.MEF2D表達(dá)水平升高預(yù)示惡性膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良。
　　為了研究MEF2D的在患有惡性膠質(zhì)瘤患者預(yù)后中的作用，我們使用qRT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)惡性膠質(zhì)瘤患者中ME

11、F2D的mRNA水平。在Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)組織學(xué)分類的惡性膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，分為一個(gè)MEF2D高組和MEF2D低組（我們通過相對(duì)定量RQ平均值定義MEF2D高/低）。與MEF2D低組中相比，在MEF2D高組中的患者預(yù)后較差(P=0.031)。此外，這些患者的樣本MEF2D mRNA水平與世界衛(wèi)生組織分級(jí)（2007年）正相關(guān)(P=0.048)。IDH1/2突變也與MEF2D mRNA水平正相關(guān)(P=0.029)。但是，MEF2D mRNA水平和組織學(xué)

12、分類之間沒有顯著的關(guān)聯(lián)(P=0.064)。為了確認(rèn)MEF2D在腫瘤細(xì)胞中的定位，我們對(duì)惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。免疫組織化學(xué)染色表明，MEF2D蛋白主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞核中。因此，通過Western blot和免疫組化評(píng)估，MEF2D蛋白的表達(dá)水平在惡性膠質(zhì)瘤腫瘤組織與鄰近正常組織相比表達(dá)更高。MEF2D mRNA表達(dá)水平在這些樣品中也通過qRT-PCR進(jìn)行測(cè)定，MEF2D在腫瘤組織中mRNA的表達(dá)水平比相鄰的正常組織表

13、達(dá)顯著更高(P=0.03，0.02和0.02)。此外，與MEF2D的蛋白水平低的星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，U87MG，U251MG和HeLa癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞用作MEF2D陽性細(xì)胞系），MEF2D在癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平比星形膠質(zhì)細(xì)胞更高(P＜0.04)。這些結(jié)果表明，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系具有異常高表達(dá)的MEF2D。
　　2.MEF2D下調(diào)抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖。
　　因?yàn)閻盒陨窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的MEF2D表達(dá)水平高，我們用攜

14、帶特異性靶向的MEF2D mRNA的短發(fā)夾RNA的慢病毒載體（LV-shMEF2D-1，Lv-shMEF2D-2）或?qū)φ战M(LV-CTRL)感染的U87MG和U251MG細(xì)胞。感染后72小時(shí)，我們通過免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)，研究U87MG和U251MG細(xì)胞的MEF2D蛋白和mRNA的水平。在U87MG和U251MG惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，LV-shMEF2D-1和LV-shMEF2D-2導(dǎo)致了大約65-95％ MEF2D蛋白表達(dá)下

15、降。qRT-PCR數(shù)據(jù)還顯示，在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，shRNA也下調(diào)了MEF2D的mRNA水平。MEF2D下調(diào)被認(rèn)為減少了U87MG細(xì)胞的增殖。在感染Lv-shMEF2D-1或Lv-shMEF2D-2的U251MG細(xì)胞中也有同樣的情況，但對(duì)照組Lv-CTRL細(xì)胞沒有這種效果（P=0.02和0.01）。
　　此外，U87MG細(xì)胞感染Lv-shMEF2D-1或Lv-shMEF2D-2后的細(xì)胞克隆數(shù)受此影響，隨MEF2D的水平下降而

16、減少(P=0.01和0.01)。在U251MG細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果（P=0.01和0.02）。因此，MEF2D的下調(diào)可以減少U87MG和U251MG細(xì)胞中的克隆數(shù)，這表明MEF2D在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖中至關(guān)重要。
　　3.MEF2D影響惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期和凋亡。
　　4.MEF2D的過表達(dá)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　通過MTS測(cè)定感染Lv-MEF2D或LV-GFP的星形膠質(zhì)細(xì)胞的

17、增殖率。我們發(fā)現(xiàn)，MEF2D過表達(dá)增加星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖(P=0.03)。此外，與對(duì)照病毒相比(LV-GFP)，過表達(dá)MEF2D升高星形膠質(zhì)細(xì)胞的菌落數(shù)(P=0.04)。此外，我們對(duì)慢病毒過表達(dá)MEF2D的星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)行了評(píng)估的。在星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度表達(dá)MEF2D增加G0/G1期的細(xì)胞的百分比，同時(shí)降低細(xì)胞百分比中的G2/M和S期?？偟膩碚f，MEF2D促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，并加速在星形膠質(zhì)細(xì)胞G2/M期的過渡。

18、　　結(jié)論:
　　1.在惡性膠質(zhì)瘤患者標(biāo)本中，異常高表達(dá)MEF2D，從而導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤的預(yù)后較差。
　　2.通過下調(diào)MEF2D介導(dǎo)了細(xì)胞周期S期和G2/M期的阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖。
　　3.MEF2D在星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度表達(dá)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程加速細(xì)胞增殖。
　　4.裸鼠惡性膠質(zhì)瘤模型顯示，MEF2D缺乏可以阻止惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤在體內(nèi)形成。
　　5.最后我們的結(jié)論是MEF2D可