三葉因子3促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　TFF3(Trefoil Factor Family3)三葉因子3，是三葉肽家族的成員之一。其分子結(jié)構(gòu)中含有6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，由3個(gè)分子內(nèi)穩(wěn)定的二硫鍵連接，形成三葉狀結(jié)構(gòu)域，因此得名。TFF3在生理狀態(tài)下，參與修復(fù)胃腸粘膜的損傷，近些年研究表明:血清中TFF3的含量具有作為臨床對(duì)胃癌、肺癌等腫瘤評(píng)估及患者預(yù)后標(biāo)志物的轉(zhuǎn)化前景。雖然有研究報(bào)道TFF3高表達(dá)狀態(tài)，與胃腸道腫瘤、乳腺癌、食道癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但

2、TFF3參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚無報(bào)道。
　　本研究以膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及人膠質(zhì)瘤標(biāo)本為切入點(diǎn)，確認(rèn)TFF3在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，并通過敲減TFF3證實(shí)其功能。隨后，對(duì)其上下游調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討。本研究旨在探索膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TFF3高表達(dá)的生物學(xué)意義，為臨床膠質(zhì)瘤治療提供具有潛在轉(zhuǎn)化意義新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.構(gòu)建敲減TFF3、HIF-1α載體質(zhì)粒，慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，利用嘌呤霉素抗性篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

3、r>　　2.Western Blot驗(yàn)證TFF3與HIF-1α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及組織標(biāo)本中蛋白表達(dá)水平。
　　3.Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)觀察敲減TFF3及HIF-1α后膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力變化。
　　4.Transwell小室包備細(xì)胞外基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察敲減TFF3及HIF-1α后膠質(zhì)瘤細(xì)胞突破基質(zhì)膠侵襲轉(zhuǎn)移能力變化。
　　5.免疫組織化學(xué)染色觀察TFF3及HIF-1α在膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本中表達(dá)情況。
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4、.卡方檢驗(yàn)探究TFF3與HIF-1α在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中免疫組化染色評(píng)分相關(guān)性分析。
　　7.組織熒光染色TFF3及HIF-1α，利用共聚焦顯微鏡觀察二者共定位情況。
　　8.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，檢測(cè)敲減TFF3后，轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性變化。
　　9.免疫共沉淀技術(shù)，檢測(cè)TFF3與HIF-1α在體相互作用情況。
　　10.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TFF3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中以及腫瘤標(biāo)本中表達(dá)情況。
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5、1.BrdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減TFF3及HIF-1α后，膠質(zhì)瘤穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系增殖率的變化。
　　12.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲減TFF3及HIF-1α后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡率變化。
　　13.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲減TFF3及HIF-1α后，細(xì)胞在體增殖及腫瘤體積變化。
　　14.Kaplan-Meier檢驗(yàn)分析TFF3表達(dá)與患者及顱內(nèi)原位荷瘤小鼠的中位生存期變化。
　　結(jié)果:
　　1.TFF3在膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本及膠質(zhì)瘤

6、細(xì)胞系中，蛋白表達(dá)升高。
　　2.TFF3的mRNA在膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)升高。
　　3.TFF3表達(dá)高的膠質(zhì)瘤患者生存期較TFF3低表達(dá)患者短。
　　4.TFF3促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，抑制其凋亡。
　　5.HIF-1α在膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。
　　6.TFF3與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)。
　　7.TFF3與HIF-1α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及組織標(biāo)本中存在共定

7、位。
　　8.TFF3蛋白與HIF-1α蛋白在體內(nèi)存在互相作用。
　　9.TFF3上調(diào)HIF-1α表達(dá)，并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。
　　10.敲低TFF3的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，在小鼠顱內(nèi)成瘤后，小鼠的生存期比對(duì)照組顯著延長。
　　結(jié)論:
　　在膠質(zhì)瘤中，TFF3可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移并抑制其凋亡。TFF3在常氧狀態(tài)下，與HIF-1α存在相互作用，調(diào)節(jié)HIF-1α表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的生物學(xué)作用。在體