Survivin促進(jìn)膠質(zhì)瘤血管形成機(jī)制的研究.pdf

1、凋亡蛋白抑制因子家族是一類重要的抗細(xì)胞凋亡因子，該家族結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是N端含有一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)的桿狀病毒IAP重復(fù)序列，C端含或不含有一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)。Survivin是IAP家族中的一個(gè)重要成員，具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡作用，并在維持細(xì)胞有絲分裂以及血管形成過程中扮演重要角色。血管生成調(diào)節(jié)異常是惡性腫瘤的重要特征之一。研究提示，Survivin與多種人類腫瘤的血管形成有著密切的關(guān)系。
　　腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率約

2、占顱內(nèi)腫瘤的45％。盡管包括手術(shù)、放療以及化療在內(nèi)的腦膠質(zhì)瘤綜合治療水平在不斷提高，但該病的治療效果仍未得到明顯的改善，惡性腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后中位生存期尚不足一年。腦膠質(zhì)瘤治療困難的根源與其所具有的惡性生物學(xué)特性密切相關(guān)。研究表明，旺盛的血管形成是腦膠質(zhì)瘤最重要的惡性表型之一。揭示參與腦膠質(zhì)瘤血管形成的關(guān)鍵基因?qū)τ诠タ诉@一頑疾有著重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。目前，Survivin在膠質(zhì)瘤血管形成中的作用和機(jī)制尚不完全清楚，根據(jù)以往的研究

3、結(jié)果，我們推測(cè)在膠質(zhì)瘤中存在一個(gè)Survivin-促血管形成因子之間相互促進(jìn)的正反饋調(diào)節(jié)通路，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤血管形成，導(dǎo)致腫瘤演進(jìn)?；诖?，本課題從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究。
　　1.促血管形成因子對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Survivin表達(dá)的影響
　　目的：探討促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44和U251中Survivin表達(dá)的影響。
　　方法：在體外培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44（無Surviv

4、in表達(dá)）和U251（高表達(dá)Survivin）培養(yǎng)液中分別加入重組人VEGF、bFGF和PDGF，每種細(xì)胞分為若干組，分別在含終濃度為0、25、50、100ng/mlVEGF，0、1、2.5、5、10、20ng/mlbFGF和0、5、10、20、40ng/mlPDGF的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h后，收集各組細(xì)胞的總蛋白；同時(shí)，每種細(xì)胞分別在含終濃度為100ng/mlVEGF、10ng/mlbFGF、10ng/mlPDGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)0

5、、6、24、48、72h后，同樣收集總蛋白。采用Western blot方法，檢測(cè)以上各組Survivin基因蛋白表達(dá)水平。同前，每種細(xì)胞分別在含終濃度為100ng/mlVEGF、10ng/mlbFGF、10ng/mlPDGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)0、3、6、12、24h后，提取各組細(xì)胞的總RNA。采用Real-timeRT-PCR，檢測(cè)各組Survivin基因RNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：PDGF能夠在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)SHG-44細(xì)胞和U2

6、51細(xì)胞Survivin基因的表達(dá)，并且這種上調(diào)作用呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性。對(duì)于SHG44，10ng/mlPDGF作用3h和12h，Survivin基因mRNA和蛋白表達(dá)水平分別達(dá)到高峰，此后逐漸下降，最低5ng/ml水平的PDGF作用24h后即能上調(diào)SHG44細(xì)胞Survivin基因蛋白表達(dá)水平。對(duì)于U251，10ng/mlPDGF作用于6～12h和24～48h，Survivin基因RNA和蛋白表達(dá)水平分別達(dá)到高峰，此后逐漸下降，最低5

7、ng/ml的PDGF作用24h后同樣可見U251細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)水平升高。bFGF能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)U251細(xì)胞Survivin基因的表達(dá)，并呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性，而對(duì)SHG-44細(xì)胞無作用。10ng/mlbFGF作用于U251細(xì)胞6h和12～24h，Survivin基因mRNA和蛋白表達(dá)水平分別達(dá)到高峰，此后逐漸下降，低于10ng/ml的bFGF作用24h后未見Survivin蛋白表達(dá)水平提高。VEGF在設(shè)計(jì)的時(shí)間和濃度范

8、圍內(nèi)對(duì)兩種細(xì)胞Survivin基因的表達(dá)均無上調(diào)作用。
　　結(jié)論：血管形成因子bFGF和PDGF除直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移而發(fā)揮促血管形成作用外，還可能通過Survivin基因介導(dǎo)的信號(hào)途徑間接參與了膠質(zhì)瘤的血管形成過程。
　　2.Survivin基因真核表達(dá)載體和RNA干擾載體的構(gòu)建、鑒定及細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　目的：構(gòu)建Survivin基因的真核表達(dá)載體和Survivin基因特異性RNA干擾載體，并分別轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)

9、胞系SHG44和U251，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　方法：利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，擴(kuò)增Survivin基因編碼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切后定向克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1中，成功構(gòu)建Survivin基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SVV。設(shè)計(jì)合成針對(duì)Survivin基因和針對(duì)熒火蟲熒光素酶（FLF）基因特異性RNA干擾片斷，后者作為針對(duì)人類基因的非靶向性無關(guān)插入序列，分別將兩干擾片段連接入載體中，成功構(gòu)建Survivin基因

10、RNA干擾載體和無關(guān)序列載體。采用脂質(zhì)體法，將pcDNA3.1、pcDNA3.1-SVV轉(zhuǎn)染SHG44細(xì)胞，將pSilencer3.1-SVV、pSilencer3.1-FLF和pSilencer3.1-H1neo轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，采用Real-timeRT-PCR、Westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法分別檢測(cè)Survivin基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：酶切鑒定和核苷酸序列分析證實(shí)，成功

11、構(gòu)建了Survivin基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SVV和Survivin基因RNA干擾載體pSilencer3.1-SVV；獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-SVV、pSilencer3.1-SVV、pSilencer3.1-FLF和pSilencer3.1-H1neo的細(xì)胞系，分別命名為SHG44-P、SHG44-S、U251-S、U251-F和U251-P。經(jīng)蛋白和RNA水平鑒定，SHG44-S細(xì)胞中Surv

12、ivin基因穩(wěn)定表達(dá)，U251-S細(xì)胞中Survivin基因表達(dá)受到明顯抑制，抑制率為70％，SHG44-P細(xì)胞中無Survivin基因表達(dá)，U251-F和U251-P細(xì)胞中Survivin基因表達(dá)水平無明顯變化。
　　結(jié)論：真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SVV使Survivin基因在SHG44細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。Survivin基因特異性RNA干擾載體pSilencer3.1-SVV能夠明顯抑制Survivin基因在U251細(xì)胞中的

13、表達(dá)。這為Survivin基因促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管形成機(jī)制的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3.促血管形成因子在體外培養(yǎng)的穩(wěn)轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)的變化
　　目的：比較基因轉(zhuǎn)染前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44和U251中三種促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF表達(dá)的變化，探索Survivin基因能否通過三種促血管形成因子介導(dǎo)參與膠質(zhì)瘤血管形成過程。
　　方法：分別提取體外培養(yǎng)的SHG-44、SHG44-P、SHG44-S以及U25

14、1、U251-P、U251-F和U251-S細(xì)胞總RNA和總蛋白。采用Real-timeRT-PCR、Westernblot，分別檢測(cè)三種促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的mRNA和蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA方法檢測(cè)各組細(xì)胞三種促血管形成因子分泌水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行圖像和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：蛋白水平，SHG44-S細(xì)胞胞漿和上清中出現(xiàn)bFGF表達(dá)而未見VEGF、PDGF表達(dá)，SH

15、G44-P和SHG44細(xì)胞胞漿和上清中始終未見VEGF、bFGF和PDGF表達(dá)；U251-S細(xì)胞胞漿和上清中VEGF、bFGF表達(dá)水平明顯下降，分別下降為轉(zhuǎn)染前水平的50％和30％，PDGF表達(dá)水平無變化。然而，轉(zhuǎn)染空白和無關(guān)序列載體后，U251-P和U251-F細(xì)胞VEGF、bFGF和PDGF蛋白表達(dá)水平均未見明顯變化。mRNA水平結(jié)果與蛋白水平結(jié)果一致。
　　結(jié)論：上調(diào)Survivin基因表達(dá)，SHG44細(xì)胞中bFGF的表達(dá)從