內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）在膠質(zhì)瘤微血管構(gòu)筑表型異質(zhì)性形成中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、惡性實(shí)體瘤(malignantsolidtumors)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤內(nèi)血管新生(neovascularization)。腫瘤血管新生機(jī)制涉及由原血管床成熟內(nèi)皮芽生的血管生成(angiogenesis)和由骨髓動(dòng)員的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcell，EPCs)歸巢腫瘤原位分化、增殖而來的血管形成(vasculogenesis)。盡管血管生成機(jī)制和抗血管生成一直是近些年腫瘤研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)，但抗腫瘤血管

2、生成治療效果不顯著。其根本原因可能是骨髓EPCs不僅參與血管形成，而且能整合瘤周內(nèi)芽生血管并形成不同內(nèi)皮細(xì)胞來源的混合性血管。 本課題組新近提出腫瘤微血管構(gòu)筑表型異質(zhì)性(tumormicrovasculararchitecturephenotypeheterogeneity，T-MAPH)的概念，并認(rèn)為T-MAPH的存在是抗腫瘤血管生成治療障礙的關(guān)鍵因素。作為參與腫瘤新生血管的關(guān)鍵細(xì)胞，很少有人注意到EPCs在T-MAPH形成中

3、的作用及機(jī)制。人腦惡性膠質(zhì)瘤具有高血管生成活性，且微血管密度越高，患者預(yù)后越差，被認(rèn)為是研究T-MAPH的作用及機(jī)制的良好模型。 EPCs是從骨髓、臍血或外周血分離并具有CD34、VEGFR2和或CD133陽(yáng)性標(biāo)志細(xì)胞，能夠在趨化因子和生長(zhǎng)因子等刺激下募集并歸巢于腫瘤血管新生位點(diǎn)，原位分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與腫瘤血管形成。另外，EPCs不但參與腫瘤血管形成，而且還可以促進(jìn)由原微血管床芽生血管生成。并且越來越多的研究證實(shí)，EPCs參與

4、腫瘤的血管新生，在腫瘤生長(zhǎng)中具有重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，T-MAPH不僅表現(xiàn)在與正常血管的不同，而且還表現(xiàn)在不同腫瘤之間、同種腫瘤不同個(gè)體之間、同一腫瘤不同區(qū)域和發(fā)生演進(jìn)階段之間，腫瘤組織的微血管之間在密度、形態(tài)、結(jié)構(gòu)(組成)、三維分布上的差異性和多樣性。因此，作為參與腫瘤新生微血管的關(guān)鍵細(xì)胞，EPCs是否或如何與瘤內(nèi)原血管床的芽生成熟內(nèi)皮發(fā)生連接或吻合參與腫瘤微血管網(wǎng)以及這些血管網(wǎng)是否具有多樣性和異質(zhì)性，尚不清楚。 與

5、成熟內(nèi)皮細(xì)胞相比，EPCs高表達(dá)趨化因子受體CXCR4，此受體的表達(dá)與活化在EPCs參與血管新生中可能具有重要作用。EPCs中CXCR4被其配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal-cellderivedfactor-1，sDF-1)活化后通過G蛋白耦連受體介導(dǎo)EPCs參與血管新生。有研究者證實(shí)，SDF-1在募集骨髓nicheCXCR4+EPCs進(jìn)入新生血管活躍區(qū)原位分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與血管發(fā)生中起著主要作用。并且SDF-1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、

6、分化、芽生和管型形成及阻止EPCs凋亡。另外，研究者證實(shí)淋巴瘤患者尸檢淋巴組織整合血管內(nèi)的EPCs中CXCR4mRNA的表達(dá)高于循環(huán)EPCs中CXCR4mRNA水平，并且EPCs高表達(dá)CXCR4mRNA與腫瘤微血管密度和腫瘤體積成正相關(guān)。臨床前研究發(fā)現(xiàn)拮抗SDF-1/CXCR4信號(hào)可有效阻斷SDF-1促腫瘤血管新生作用。本課題組前期研究證明，CXCR4活化誘導(dǎo)VEGF和IL-8表達(dá)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤T-MAPH作用。但SDF-1/CXCR4軸

7、活化是否參與介導(dǎo)EPCs參與T-MAPH形成，尚缺乏研究。 為了解CXCR4活化后介導(dǎo)EPCs參與膠質(zhì)瘤T-MAPH的作用及機(jī)制，我們觀測(cè)了EPCs參與人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87裸鼠皮下移植瘤微血管構(gòu)筑表型，并對(duì)EPCs的CXCR4活化是否介導(dǎo)EPCs的遷移及其在膠質(zhì)瘤T-MAPH形成中的作用進(jìn)行探索。首先，我們觀測(cè)了從人臍血分離、鑒定的EPCs生物學(xué)特性，研究了在體外標(biāo)記并經(jīng)尾靜脈移植的EPCs歸巢于U87移植瘤內(nèi)參與T-MAP

8、H形成在微血管密度、形態(tài)和三維結(jié)構(gòu)分布等方面的表現(xiàn)；最后，我們探討了EPCs中CXCR4活化介導(dǎo)EPCs遷移及其在膠質(zhì)瘤微血管表型形成中的作用，并觀測(cè)了CXCR4受體抑制劑AMD3100對(duì)SDF-1/CXCR4軸介導(dǎo)上述效應(yīng)的抑制作用。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.從人臍血中分離、鑒定的EPCs具有自我更新、可被誘導(dǎo)分化和形成小管樣結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性。 ①應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、密度梯度離心聯(lián)合專用培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果顯示，新

9、鮮分離的CBMCs中存在CD34+/CD133+細(xì)胞(1.06％)，在添加了生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)4d后，CD34表達(dá)增加，CD133表達(dá)減少，CD34+/CD133+減少(0.26％)，由祖細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化。 ②免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，獲得的單核源性EPCs，可表達(dá)CD14CD34和KDR，吞噬DiI-Ac-LDL，并能連接FITC-UEA-1。另一類是晚期增殖性EPCs，在內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液中生長(zhǎng)具有形成初級(jí)集落和次集集落能力

10、；CD133、CD34、KDR、vWF、CD31，DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-1皆呈陽(yáng)性表達(dá)。 ③Matrigel管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述兩亞型的EPCs在Matrigel中均可形成小管樣結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明，從人臍血分離單個(gè)核細(xì)胞(CBMCs)經(jīng)內(nèi)皮培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的EPCs具有自我更新、誘導(dǎo)分化和形成小管樣結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性。 2.人源性EPCs特異地整合到膠質(zhì)瘤細(xì)胞異種移植瘤宿主源性新生微血管中，并形成

11、人-鼠嵌合性血管。將膜熒光染料CFSE標(biāo)記的EPCs經(jīng)鼠尾靜脈植入經(jīng)60Co亞致死劑量輻射后荷人U87細(xì)胞移植瘤的裸鼠體內(nèi)， ①免疫熒光染色顯示，遷移到U87裸鼠移植瘤內(nèi)CFSE+EPCs數(shù)量明顯高于肝脾組織(p＜0.01)。 ②免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)顯示，CFSE+EPCs以兩種形式參與血管新生：?jiǎn)蝹€(gè)或成簇的EPCs散在分布于鼠源性的血管旁，形成盲端或功能性的血管；或與鼠源性血管連接整合形成人-鼠嵌合性微血管。定量結(jié)

12、果顯示EPCs參與形成的新生血管占總血管的113～18.6％。 ③免疫熒光染色結(jié)果顯示，CFSE+/CD31+EPCs與鼠源性CD31陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞組成的混合性血管形態(tài)表現(xiàn)多樣：或呈樹桿分支樣，或呈蛇形蜿蜒，或呈實(shí)性條索，或呈血竇狀。三維重建結(jié)果顯示，人源性CFSE+EPCs與鼠源性CD31+內(nèi)皮細(xì)胞相互連接和或吻合構(gòu)建成雜亂的人-鼠嵌合性新生微血管網(wǎng)，血管分支長(zhǎng)短、大小和管壁厚薄不等。人源性CFSE+EPCs連接或聚集于鼠源性

13、血管分支處形成多層內(nèi)皮細(xì)胞的厚壁血管，鼠源性內(nèi)皮細(xì)胞組成薄壁血管。在上述微血管結(jié)構(gòu)中鼠源性內(nèi)皮細(xì)胞主要分布于血管主體，而CFSE+細(xì)胞分布于血管盲袢或新生血管分支點(diǎn)。應(yīng)用IPP圖形軟件定量分析CFSE+EPCs組成的血管段與人-鼠嵌合性新生微血管網(wǎng)的物理參數(shù)，結(jié)果顯示，CFSE+EPCs組成的血管段像素值約為總血管的(26±7)％，血管長(zhǎng)度占總血管的(22±5)％，而血管分支點(diǎn)占總血管的(36±1)％。 ④人源性EPCs增強(qiáng)耐受

14、骨髓損傷的裸鼠膠質(zhì)瘤模型微血管密度(P＜0.01)，增加移植瘤幼稚微血管新生比例(P＜0.05)，且促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)(P＜0.05)。以上結(jié)果表明，體外植入的EPCs特異地歸巢并整合于U87細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤新生血管位點(diǎn)，從形態(tài)、三維分布和MVD上體現(xiàn)了EPCs參與形成VT-MAPH，進(jìn)而促進(jìn)移植瘤生長(zhǎng)。 3.SDF-1/CXCR4軸活化介導(dǎo)EPCs遷移并促進(jìn)EPCs參與膠質(zhì)瘤T-MAPH形成。 ①間接免疫熒光顯示，EPC

15、s表達(dá)SDF-1和CXCR4。 ②MTT結(jié)果顯示，不同濃度的SDF-1(9、19、37.5、75和150μg/L)在24、48和72h活化CXCR4后能明顯誘導(dǎo)EPCs增殖，各組平均吸光度值均顯著高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。CXCR4的小分子抑制劑ADM3100在24、48和72h能有效拮抗CXCR4活化介導(dǎo)的EPCs增殖作用(P＜0.05)。 ③遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，19μg/LSDF-1活化CXCR4后能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞

16、遷移(P＜0.05)。相/反，AMD3100能顯著拮抗CXCR4活化對(duì)EPCs的遷移作用(P＜0.05)。 ④Matrigel管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)顯示，EPCs表達(dá)的CXCR4活化后EPCs形成小管樣結(jié)構(gòu)數(shù)為16.3±2.2。AMD3100能明顯減少EPCs小管樣結(jié)構(gòu)形成，平均數(shù)為6.4±1.8。 ⑤植入EPCs的移植瘤組織SDF-1和VEGF表達(dá)量顯著高于未植入EPCs(即對(duì)照組)的移植瘤組織(P＜0.05)。SDF-1和

17、VEGF表達(dá)量與腫瘤微血管密度呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，EPCs可通過自分泌或旁分泌作用活化CXCR4進(jìn)而介導(dǎo)EPCs增殖、遷移、管樣結(jié)構(gòu)形成并參與T-MAPH形成。而AMD3100具有抑制SDF-1/CXCR4軸介導(dǎo)的上述效應(yīng)的作用。 綜上所述，本研究從人臍血中分離、鑒定出的EPCs具有自我更新、誘導(dǎo)分化和形成小管樣結(jié)構(gòu)的生物學(xué)特性，植入的人源性EPCs能特異地歸巢到U87細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤內(nèi)新生血管位點(diǎn)，通過連接或整合瘤內(nèi)成熟