miRNA-451在膠質(zhì)瘤細胞增殖—遷移表型轉(zhuǎn)換中的開關(guān)作用.pdf

1、膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma, GBM)是侵襲性最強的惡性膠質(zhì)瘤，也是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，屬人類預(yù)后極差的腫瘤之一[1]。如果僅進行支持治療，膠質(zhì)母細胞瘤病人的中位生存期不足3個月，97％的病人在12月內(nèi)死亡;對于手術(shù)治療病人，由于腫瘤細胞在腦實質(zhì)內(nèi)呈彌漫浸潤性生長，常不能實現(xiàn)滿意的擴大切除。面對并不樂觀的現(xiàn)狀，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)工作者依然不懈的致力于對膠質(zhì)母細胞瘤治療手段的研究。近十余年來，微創(chuàng)理念和影像導(dǎo)引外科等新技術(shù)的

2、不斷發(fā)展，顯著提高了惡性腦腫瘤影像學(xué)全切除率，并降低了術(shù)后致殘、致死率，同時各種改良的綜合治療措施和新療法也為膠質(zhì)母細胞瘤的治療帶來了新希望。目前，盡管腫瘤切除手術(shù)后替莫唑胺(temozolomide，TMZ)聯(lián)合常規(guī)分割照射的標準治療方案有了值得關(guān)注的發(fā)展[2]，接受標準方案治療的新診斷的膠質(zhì)母細胞瘤患者相對于單純放療的患者二年生存率由10.9％提高到27.2％，三年生存率由4.4％提高到16％，但膠質(zhì)母細胞瘤的侵襲遷移生物學(xué)特性依然

3、嚴重制約著各種治療手段的進一步提高。
　　腫瘤細胞的增殖和運動密切相關(guān)。早在1996年就有研究提出了腫瘤細胞的“go or grow”假說[3，4]。當(dāng)腫瘤細胞所處的局部微生態(tài)環(huán)境不利于腫瘤細胞的增殖時，腫瘤細胞會遷移至適宜腫瘤細胞生存和增殖的環(huán)境。在這一過程中，腫瘤細胞在適合的微環(huán)境中進行增殖與遷移表型的轉(zhuǎn)換，啟動相應(yīng)的生物學(xué)變化。盡管對腫瘤細胞遷移運動和增殖轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機制還很不清楚，但腫瘤細胞的運動與增殖表型轉(zhuǎn)換肯定不是受

4、外部因素單獨影響的，在細胞增殖和細胞運動兩種表型復(fù)雜的分子和信號通路調(diào)控之間，細胞內(nèi)應(yīng)該存在一個表觀遺傳學(xué)的調(diào)控開關(guān)。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，對基因表達進行抑制性調(diào)控，調(diào)節(jié)包括增殖，分化，凋亡等多種腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展過程[5]。最近研究表明，miR-451在遷移運動的膠質(zhì)瘤細胞中明顯下調(diào)，miR-451調(diào)節(jié)KB1-AMPK通路，可能使膠質(zhì)瘤細胞在不同的萄萄糖環(huán)境中分別表現(xiàn)出增殖活性

5、和遷移運動活性[6]。
　　本研究主要討論miR-451對膠質(zhì)瘤細胞增殖和運動的作用，對膠質(zhì)瘤細胞增殖相關(guān)蛋白mTOR和遷移調(diào)控蛋白Rac1活性的影響，以及miR-451調(diào)控AMPK，mTOR， Rac1蛋白的激活狀態(tài)的潛在機制。
　　本課題研究分為以下兩個部分:
　　第一部分明確miR-451在人腦膠質(zhì)瘤中的表達情況，觀察miRNA-451對膠質(zhì)瘤細胞增殖和運動的影響。我們收集40例膠質(zhì)母細胞瘤(WHOⅣ)標本以及6

6、例顳葉癲癇手術(shù)患者的對照腦組織。本課題組運用qRT-PCR檢測不同標本中miR-451的表達情況。通過將miR-451類似物和抑制物轉(zhuǎn)染U87、U251、SNB19三個人腦膠質(zhì)瘤細胞系，探討miRNA-451對膠質(zhì)瘤細胞增殖和運動能力的作用。qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效果;MTT實驗檢測細胞增殖活性;體外劃痕實驗和transwell遷移實驗檢測細胞的遷移能力。結(jié)果顯示:膠質(zhì)母細胞瘤組織中miR-451的相對表達量是對照腦組織的(33.58±

7、5.19)％;MTT實驗表明miR-451對膠質(zhì)瘤細胞增殖能力呈正性調(diào)節(jié)作用;劃痕實驗和transwell遷移實驗發(fā)現(xiàn)miR-451對膠質(zhì)瘤細胞運動能力呈負性調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分miR-451對膠質(zhì)瘤細胞增殖及運動能力作用的潛在機制。1.課題組將miR-451類似物和抑制物轉(zhuǎn)染進入U87、U251、SNB19三個人腦膠質(zhì)瘤細胞系，運用qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效果;western blot技術(shù)檢測不同處理組細胞中p-AMPK、AM

8、PK、p-Raptor、Raptor、Rac1的表達;GST-pulldown技術(shù)檢測GTP-Rac1表達。結(jié)果顯示:各組細胞中AMPK、Raptor、Rac1的表達與miR-451的表達無明確相關(guān)性;p-AMPK、GTP-Rac1的表達量與miR-451表達呈負相關(guān)，與p-Raptor的表達呈正相關(guān)。2.為了進一步驗證結(jié)論，我們通過RNA干擾技術(shù)沉默U87、U251、SNB19三個人腦膠質(zhì)瘤細胞系中AMPKa1的表達，在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染m

9、iR-451類似物和抑制物，qRT-PCR和western blot驗證轉(zhuǎn)染效果;MTT實驗檢測細胞增殖活性;體外劃痕實驗和transwell遷移實驗檢測細胞的遷移能力;western blot技術(shù)檢測不同處理組中p-AMPK、AMPK、p-Raptor、Raptor、Rac1的表達;GST-pulldown技術(shù)檢測GTP-Rac1表達。結(jié)果顯示:敲低AMPKa1后，miR-451對細胞增殖，遷移能力及相關(guān)蛋白p-Raptor、GTP-