膠質(zhì)瘤中Arp2-3蛋白表達和其在膠質(zhì)瘤細胞動中作用的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腦腫瘤，而膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是最常見及惡性級別最高的原發(fā)惡性腦腫瘤，占到所有顱內(nèi)腫瘤的12％～15％，星形細胞腫瘤的60％～75％。盡管手術(shù)切除及術(shù)后輔助同步放化療方案應用于膠質(zhì)母細胞瘤患者取得了一定效果，但膠質(zhì)母細胞瘤患者的兩年生存率僅約為25％。惡性膠質(zhì)瘤廣泛浸潤到相鄰腦組織以及容易復發(fā)的趨勢使其難以根治。即使腫瘤在影像學全切之后，80％以上的膠質(zhì)母細胞瘤會在原

2、發(fā)腫瘤邊緣2 cm以內(nèi)復發(fā)。因此，尋找更好的治療方法，如:有效控制疾病進展和復發(fā)極為必要，其中方法之一就是控制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲和遷移。肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3復合物(actin-related protein2/3 complex，Arp2/3complex)作為小Rho GTP酶-WAVE下游的一個重要效應器可以直接調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合作用，在細胞運動過程中起到不可或缺的作用。當細胞受到外界刺激（如:趨化因子）時，Arp2/3接受Rho

3、GTP酶-WAVE信號轉(zhuǎn)導綁定到原有肌動蛋白絲側(cè)面調(diào)節(jié)新的肌動蛋白絲形成，進而形成片狀偽足，為細胞運動提供必要的動力支持。本文主要研究Arp2/3在膠質(zhì)瘤中的表達和對膠質(zhì)瘤細胞片狀偽足形成的影響以及細胞運動的調(diào)節(jié)，分為以下兩個部分：
　　 ㈠Arp2/3在人膠質(zhì)瘤中的表達情況。為探討Arp2/3在膠質(zhì)瘤中的表達情況及Arp2/3與膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性，我們收集了50例不同病理級別的膠質(zhì)瘤標本以及8例顳葉癲癇手術(shù)患者的對照腦組織

4、。本課題在實驗過程中，首先采用免疫熒光技術(shù)檢測不同標本中Arp2/3的表達情況，結(jié)果顯示在對照腦組織當中Arp2/3熒光表達呈陰性或弱陽性，而在膠質(zhì)瘤組織標本中熒光表達強度明顯增強并且其熒光強度隨著腫瘤級別的增高而增強(F=83.538，P=0.000)。Western blot方法用于進一步半定量評估各組織中Arp2/3的表達情況，結(jié)果顯示對照腦組織當中Arp2/3表達量為15.69±1.04％(n=8)，WHOⅠ級膠質(zhì)瘤標本中表達量

5、為31.17±4.30％(n=8)，WHOⅡ級膠質(zhì)瘤標本中Arp2/3表達量為40.51±2.12％(n=14)，WHOⅢ級膠質(zhì)瘤標本中Arp2/3表達量為48.68±2.69％(n=10)，WHOⅣ級膠質(zhì)瘤標本中Arp2/3表達量為55.42±3.45％(n=18)。數(shù)據(jù)分析顯示膠質(zhì)瘤中Arp2/3表達量高于對照腦組織當中Arp2/3表達量(P＜0.05)，并且Arp2/3表達量與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)（r=0.686,P=0.02

6、）。
　　 ㈡Arp2/3在膠質(zhì)瘤細胞片狀偽足形成及細胞遷移和侵襲中的作用。①我們通過Arp2/3特異性抑制劑下調(diào)Arp2/3活性，探討Arp2/3在膠質(zhì)瘤細胞片狀偽足形成及細胞遷移和侵襲中的作用。細胞免疫熒光技術(shù)和劃痕實驗觀察片狀偽足在細胞中的形成情況及其與細胞運動方向的關(guān)系;MTT實驗檢測Arp2/3特異性抑制劑對膠質(zhì)瘤細胞活性的影響;細胞免疫熒光技術(shù)觀察Arp2/3在膠質(zhì)瘤細胞中的定位情況;倒置相差顯微鏡下觀察抑制Arp2

7、/3活性后膠質(zhì)瘤細胞形態(tài)的變化;體外劃痕實驗和transwell侵襲實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果:膠質(zhì)瘤細胞的片狀偽足朝向劃痕區(qū)域;Arp2/3定位到細胞的片狀偽足，抑制Arp2/3活性后細胞片狀偽足逐漸變小甚至消失;劃痕實驗和transwell侵襲實驗檢測發(fā)現(xiàn)抑制Arp2/3活性后細胞運動能力明顯下降(P＜0.05)。②由于抑制藥的特異性畢竟有限，我們通過RNA干擾技術(shù)沉默U251膠質(zhì)瘤細胞中Arp2/3的表達，進一步驗證Arp

8、2/3在膠質(zhì)瘤細胞片狀偽足形成及細胞遷移和侵襲中的作用。逆轉(zhuǎn)錄PCR和western blot驗證干擾效果;細胞免疫熒光實驗、劃痕實驗和transwell侵襲實驗檢測敲低Arp2/3后對膠質(zhì)瘤細胞片狀偽足形成和細胞運動的影響。結(jié)果:敲低Arp2/3后，U251膠質(zhì)瘤細胞中未見明顯片狀偽足形成，并且細胞的運動能力明顯下降。研究表明：Arp2/3在對照腦組織中無表達或弱表達，在不同級別膠質(zhì)瘤中均有表達，并且表達水平與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)